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当前位置:首页 » 新闻资讯 » 技术&解读&应用 » 单细胞测序技术分享 | T淋巴细胞白血病

前 言

T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种儿童中常见的恶性肿瘤,由于未成熟的T细胞克隆增殖导致。随着测序技术的不断发展,NGS技术提供了与T-ALL发病机制相关的各种基因组损伤/病变的详细概述。研究发现,在T-ALL中,CDKN2A/2B和NOTCH1是最容易受到影响的基因。此外,在诊断中发现T-ALL细胞中有10到20个蛋白质改变的病变。然而,目前还不清楚这些突变是以怎样的顺序获得的,以什么顺序启动了这些祖细胞。

为了解决以上问题,本研究对4例T-ALL患者的全骨髓细胞和CD34+CD38-多能干细胞进行靶向单细胞测序(DNA和RNA单细胞测序)。

 

结果分析

01

利用全基因组和转录组测序鉴定体细胞突变

对4个T-ALL儿童的骨髓样本进行全基因组和RNA-seq,测序结果发现,每个病人的肿瘤样本平均有10个编码变异。此外,发现了一些融合基因、大的缺失和体细胞突变存在于5’-UTR和3’-UTR区以及剪切位点。

Fig. 1 Somatic variant identification by bulk sequencing of four primary T-ALL samples

02

靶向单细胞测序和质控

我们从每个病人中分离了333个白血病细胞。对单细胞基因组扩增后,利用病人特异性primer对感兴趣的区域进行测序。结合单细胞的突变型等位基因频率(VAF)比较每个突变的VAFs,发现总体上呈良好的相关性,除了XB47患者,其单细胞VAF在所有突变中始终低于整体的VAF。

Fig. 2 Targeted single-cell sequencing of four primary T-ALL samples

为了过滤低质量细胞,我们研究了每个细胞杂合性SNP的位点和等位基因脱落(ADO)率。将位点丢失率(LDO)定义为SNPS与<4 reads的比例。高LDO比例表明细胞中的许多SNP具有低覆盖率,表明基因组的较大区域未扩增。ADO表明,如果只有一个等位基因被扩增,SNP的杂合度可能会丢失。之前的研究表明,质控之后只有那些SNP中少于1/3受LDO和ADO联合影响的细胞被认为具有足够的质量并用于进一步分析。在1332个分离的单白血病细胞中,649个符合这些标准,且这些细胞数量在不同患者之间有显著性差异。

03

靶向单细胞测序揭示了4个T-ALL clusters

对测序数据进行聚类分析,发现每个病人都有一个高度突变的优势细胞群体,从28-94%不等,并伴随着一些较少突变的小簇。

Fig. 3 T-ALL patient samples have limited heterogeneity at presentation. Columns represent single cells, rows represent the somatic variations.

04

单细胞测序揭示了T-ALL细胞的转录均匀性

平均每个病人分析2074个细胞,以进一步探究T-ALL样本的异质性。结果发现白血病细胞始终聚类在一起,表明在T-ALL细胞之间的转录异质性有限。其他簇代表正常B细胞、单核细胞、NK T细胞、干细胞,甚至少数产生血红蛋白的红细胞(祖细胞)。

CD19 and CD33 expression represent negative controls

对白血病细胞的一些表面marker的基因表达进行评估,并与其诊断时的免疫表型进行匹配。与靶向DNA测序数据一致,XB47患者只含有47%的白血病T细胞。

05

T-ALL突变可以在CD34+CD38-多能干细胞中启动

CD34+CD38-细胞与其他样本一样的测序和质控标准。


4个T-ALL患者中有2个患者(X09, XB41)的CD34+CD38-祖细胞显示高度突变的特征。大多数这些突变也在诊断性骨髓定向祖细胞中检测到,与患者在干细胞或多能祖细胞中获得的突变相一致。但是,患者的病情缓解后,这些高度突变的多能祖细胞就可以被清除掉。相反,对于另外2个病人(XB37, XB47),在CD34+CD38-细胞和骨髓祖细胞中检测到的突变非常少,表明这些突变中的大多数是在已经致力于淋巴系祖细胞中获得的。

Fig. 5 Multiple mutations can be present in multipotent progenitor cells.

06

靶向单细胞测序可以确定T-ALL中获得突变的顺序

 

Fig. 6 Single-cell data illuminate the mutational hierarchy in T-ALL patient samples.

END

本文系欧易生物原创

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