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干货分享 | WB、CO-IP、SDS-PAGE都有什么蛋白?

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浏览:- 发布日期:2018-10-16 10:18:00【

引言

请用如果...那么...造句。

如果想知道WB、CO-IP、SDS-PAGE都有什么蛋白?

那么请用MPI。


MPI

中文名:基于质谱的蛋白质鉴定技术

外文名:Mass spectrometry-dependent Protein Identify

简称:MPI

MPI是鹿明生物开发的一项蛋白质鉴定技术,该技术以质谱技术为核心,通过自下而上的蛋白质组学(Bottom-up proteomics )方法鉴定样本中的蛋白质种类并表征其氨基酸序列和翻译后修饰。该技术集样品特殊处理、质谱鉴定及数据分析于一体,具有高通量、高灵敏度的特点,是当前大规模蛋白质研究的主要技术。

MPI的基本流程

MPI的基本流程见下图1所示,对样品中的蛋白质进行提取后,通过胰蛋白酶将蛋白质酶切为肽段,经液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)鉴定得到肽段及其碎片离子的质荷比、保留时间等信息,随后通过搜库软件对质谱结果在已知的蛋白质组学数据库中进行搜索、匹配、组装,即可得到样本中蛋白质的种类及相对定量信息。

LC-MS/MS结合了液相色谱(HPLC)的物理分离能力和质谱(MS)的质量分析能力,极大的提高了分子检测的特异性和灵敏度,可以适用于SDS-PAGE整个泳道或单个条带、Western Blot杂交膜、CO-IP蛋白溶液、分泌蛋白、亚细胞器蛋白甚至组织总蛋白的鉴定。

此外,对于组织总蛋白等复杂度较高的样品,可以在蛋白质水平根据蛋白质的分子量对其进行SDS-PAGE分离,随后进行胶内酶切为肽段;在肽段水平也可根据肽段的疏水性亲水性的不同,用HPLC对其进行分离,此时的液相分离与液质联用中的液相可采用正交分离法,即分别在碱性条件和酸性条件下分离。MPI技术结合样品特殊处理、蛋白质组学最新质谱鉴定和数据分析,是进行生物样本蛋白质精准鉴定的理想技术。

图1


MPI的优势

在蛋白质的研究中,有多种鉴定方法,基于抗体的免疫实验是蛋白质研究的传统方法之一。针对特定蛋白质或其修饰形式的抗体广泛应用于生物化学和细胞生物学研究。

例如Western blot和酶联免疫吸附测定(ELISA)可检测和定量单个蛋白质,抗体芯片和RPPA等技术可同时检测和定量数十种蛋白质。然而抗体的开发耗费时间且价格昂贵,抗体的效价严重影响结果的好坏。

因此人们逐渐开发不依赖于抗体的蛋白质检测方法,如早期的Edman降解法,从蛋白质多肽的N端逐步化学降解至C端,在降解的过程中通过检测紫外线吸光度的办法来辨认每一个被降解下来的氨基酸残基。

但此方法需要制备较纯的肽段或者蛋白质,且存在诸多限制,如无法测量N端有化学修饰的蛋白质,遇到非α-氨基酸测序将停止等。而近年来随着质谱技术的发展,质谱法逐渐成为了蛋白质鉴定方面的首选方法。

MPI作为当前蛋白质组学研究的主流方法,无需使用抗体,相对于其他方法,有着以下几大优势:低成本高效率;通量高,一次可鉴定成百上千种蛋白质;鉴定准确性和灵敏度高;可鉴定和定量不存在抗体的蛋白质。其将蛋白质研究从单一蛋白质研究发展为复合体研究、通路研究甚至网络研究,成为蛋白质组学研究的重要技术手段。


MPI的应用

蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础,也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。MPI作为蛋白质组学研究的重要技术手段,可应用于蛋白质研究的众多方面。

例如MPI产生的蛋白质表达谱,可验证、补全基因组注释,对于了解人体生理和病理机制有着重要作用[1];比较疾病组和健康组、不同预后疾病组、或者不同药物反应疾病组间的蛋白质表达谱,寻找差异表达蛋白质,已经成为鉴定诊断、预后、药物监测生物标志物的重要手段[2; 3];蛋白质表达谱还可用于药物研究,包括药物靶标的筛选、鉴定药物选择性和效力、评价药物副作用等[4];通过抗体或化学试剂对样本中蛋白质的某种翻译后修饰富集,可用于研究蛋白质糖基化、磷酸化、泛素化等翻译后修饰情况[5];MPI同样可用于结构和功能蛋白质组的研究,细胞中有序的生物学过程几乎都是基于高级蛋白质结构和网络加以调节,MPI技术提供了对蛋白质组的组成、结构(蛋白质相互作用、蛋白质复合体和网络)和功能(对某基因敲低、过表达后蛋白质组的变化)前所未有的见解,对于揭示生理和病理状态下复杂的生物学过程和表型具有重要意义[6]。


MPI与鹿明生物

上海鹿明生物科技有限公司,作为MPI服务提供者,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过不断地完善发展,公司建立起了Labelfree、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、L-WB、MPI、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台和相应的数据整合分析平台。迄今为止,鹿明完成服务项目上万个,涉及医学、农业、生态学及工业应用等多个研究领域,协助合作伙伴在Nature Genetics,Nature Communications,Mol Cell Proteomics等期刊发表SCI论文数百篇。在MPI技术代表性应用方面,分别采用该技术解析了宿主细胞应对H7N9病毒核蛋白的调控机制[7],以及长链非编码RNA-LINC00673抑制胰腺癌的作用机制[8]。

  

再用如果...那么...造个句。

如果想做MPI?那么请找鹿明!

 

参考文献

[1] Kim M S, Pinto S M, Getnet D, et al. A draft map of the human proteome[J]. Nature, 2014, 509(7502): 575-81.

[2] Addona T A, Shi X, Keshishian H, et al. A pipeline that integrates the discovery and verification of plasma protein biomarkers reveals candidate markers for cardiovascular disease[J]. Nat Biotechnol, 2011, 29(7): 635-43.

[3] Melo S A, Luecke L B, Kahlert C, et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015, 523(7559): 177-82.

[4] Sun B B, Maranville J C, Peters J E, et al. Genomic atlas of the human plasma proteome[J]. Nature, 2018, 558(7708): 73-79.

[5] Stadlmann J, Taubenschmid J, Wenzel D, et al. Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity[J]. Nature, 2017, 549(7673): 538-542.

[6] Aebersold R, Mann M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function[J]. Nature, 2016, 537(7620): 347-55.

[7] Ningning Sun, Wanchun Sun, Shuiming Li, et al. Proteomics Analysis of Cellular Proteins Co-Immunoprecipitated with Nucleoprotein of In?uenza A Virus (H7N9)[J]. Int J Mol Sci. 2015, 16(11): 25982–25998

[8] Jian Zheng, Xudong Huang, Wen Tan, et al., Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11 degradation[J]. Nature Genetics,2016, 48:747-757.

 

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本文转自鹿明生物

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