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环状RNA的RT-PCR引物设计方法

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浏览:- 发布日期:2016-09-30 14:32:22【

随着对circRNA的研究越来越热,进行circRNA测序的研究也越来越多,通常在得到circRNA的测序结果之后,都会进行circRNA的RT-PCR检测来验证测序数据,但是环状RNA的引物设计及PCR后产生的结果是什么样子的?我们以ZKSCAN1基因的一个已知circRNA为例进行说明。

我们给出的circRNA预测结果是这样的:

通过NCBI对该序列进行比对可以确定它是ZKSCAN1的RNA剪切成环位点之间的线性序列,其方向与正常线性RNA一致,序列的两段是剪切位点:

正常PCR引物设计是这样的:

F为正向引物,它以B链为模板,合成时的碱基序列是A的原始序列;R是反向引物,它以A链为模板,合成时的碱基序列是B的原始序列,这样设计出来的引物是扩增F和R之间的序列,这个原理相信只要做过PCR的人都明白。

扩增出来的产物测序之后在NCBI中做序列比对的结果是这样的:

序列比对图是这样子:

Query和Subjct的数字是单向的。

设计环状RNA的PCR引物时,则需要将原来的引物进行反向互补,变成这个样子:

合成的引物是F’和R’,其中F’是R引物的反向互补序列,R’是F的反向互补序列,当然命名可根据个人喜好调整,只要序列别搞错就可以,当然位置也可以变化。

F’和R’结合扩增出来的片段进行测序后,将序列在NCBI中进行序列比对时结果是这样的:

看到黑色椭圆所标记的巨大区别么?这个代表不连续的mRNA分子,反映在序列上是这个样子的:

看出来了吧?Query序列被分成两段:71-298和1-72,而且71-298对应的是原mRNA序列的113bp-341bp和1bp-72bp对应的是原mRNA的707bp-782bp,从这个结果可以看出,这个RNA成环是113位置和782位置的碱基拼接到一起了。过程是这样子滴:

circRNA的引物设计及成环检测就这样进行,当然引物设计之后的实际扩增效果还需要进行实验确定,如果是想进行QPCR实验的话,扩增长度需要按照QPCR的实验要求设定。

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    【本文标签】:环状RNA RNA circRNA PCR RT-PCR realtime pcr 引物 引物设计
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