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iTRAQ —— 蛋白质组学研究的利器

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浏览:- 发布日期:2016-12-05 09:32:00【

背景

随着生物技术的飞速发展,组学这个词慢慢的被大家所熟知,包括基因组(Genomics),转录组(tranomics),蛋白组学(Proteinomics)和代谢组学(Metabolomics)等。现代测序技术的高通量和准确性使研究人员可以在很短时间内获得一个生物甚至这个物种的全部遗传信息。然而,知道了全部遗传密码即基因组序列,就可以任意控制所有的生命过程吗?事实并非如此。基因组学(genomics)告诉我们的只是一部分的信息。并且,目前我们对这部分信息的解读和认知也还不够全面和透彻。更何况基因的表达方式错综复杂,同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。关于这些方面的问题,基因组学是无法回答的。所以,科学家们又进一步提出了后基因组计划蛋白质组proteome)研究是其中的重中之重。

蛋白质组学(Proteomics)是蛋白质(protein)与 基因组学(genomics)两个词的组合体,表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组的实质是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得各个相关信息,从而实现对细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究为基础,在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。

近年来随着蛋白质组学的迅速发展,其相应的方法学研究也取得了长足的进步,一系列新技术融入了蛋白质组学研究中,极大地促进了这门学科的发展。相对和绝对定量同位素标记( iTRAQ) 技术与高度敏感性和准确性的串联质谱及多维液相色谱联用技术已成为蛋白质定性和定量研究的主要工具之一。

iTRAQ 技术的原理

iTRAQ(isobarictags for relative and absolute quantitation,同位素标记相对和绝对定量)是由AB SCIEX公司研发的一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术使用8种(或4种)不同的同位素试剂来同时标记和比较8种(或4种)不同的蛋白质样品。这些试剂(图1)由3个不同的化学标签组成:报告部分,肽反应部分和平衡部分。报告部分为客户可按需选择标记个数,肽反应基团将 iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连,可标记所有酶解肽段,平衡部位可保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比, 因此改变任一 iTRAQ试剂,不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测,分子量都完全相同。而在串联质谱中,同重元素标记肽段平衡基团在二级质谱发生中性丢失。信号离子表现为不同质荷比的峰,因此,根据波峰的高度及面积,可以得到蛋白质的定量信息。

图1:iTRAQ试剂的分子结构

iTRAQ技术的操作流程

iTRAQ技术的大体流程如图2所示。收集不同组别的样本并分别提取蛋白质,蛋白质经过还原,封闭后用胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解为肽段,所产生的肽段分别用iTRAQ试剂多重标签进行差异标记,再将标记的样本等量混合,最后用LC-MS/MS进行分析。每一个iTRAQ实验都会产生成千上万个光谱,数千个可识别多肽和上百个可鉴定蛋白。因此,生物信息学的工具和分析方法对于分析和解释这些数据是必不可少的。许多新近开发的数据管理和分析工具可以用来分析这些庞大的数据。如Pro Quant、ProteinPilot 等由iTRAQ试剂制造商提供的软件及大量其它软件。

图2:iTRAQ的操作流程

iTRAQ技术的特点

iTRAQ技术作为一种新的标记蛋白质定量技术,具有非常多的优势:首先,在同一实验中,iTRAQ可以同时对多达8种不同样本进行蛋白定量比较,基于这点它将离子抑制效应、背景噪音和仪器条件等系统误差的影响降到了最小,这一点使得其在灵敏度和准确性方面是非标记定量技术(label-free quantitation)所无法比拟的;其次,可以对样本中的几乎所有蛋白质进行标记,同时可以对磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性、定量研究,从中可以获得更为详尽的差异信息;最后,标记过程简单,在室温条件下1 h即可完成,质谱检测灵敏。因此,iTRAQ技术可以为多个不同时间段的样品分析、膜蛋白研究、疾病标志物的发现与鉴定提供定量信息,并可为感兴趣的目标蛋白进行绝对定量。

总结

随着人类基因组计划的完成,生命科学研究开启了新的纪元,进入了后基因组时代,蛋白质组学的研究是其重要的一个分支。iTRAQ凭借其强大的功能,在蛋白组的研究上发挥着巨大的作用。例如,寻找和发现区别于正常生理状态下的疾病特异表达蛋白,这有利于疾病发病机理的阐明及疾病的预防、诊断、 预后和疗效监测,并可用作新靶点来开发临床治疗药物等。总结起来:iTRAQ只是一项技术,是科研工作者的工具。在这里,小编只是告诉你它的作用,而每一个人都可以用它去完成不同的研究,去寻找新发现。

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    【本文标签】:蛋白质组学 iTRAQ 蛋白定量
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