SEARCH
技术服务021-34781616

热门搜索关键词:转录组基因组甲基化酵母文库蛋白芯片

021-34781616

当前位置:首页 » 新闻资讯 » 技术&解读&应用 » 酵母双杂交应用解析

蛋白与蛋白互作的研究方法中,酵母双杂交体系是很受欢迎的。但是在实验完成后怎样进行数据整理,使文章结构更完整。今天小编结合一篇发表于Plant Physiology上的文章(文末有链接),带大家梳理一下。


首先是,当实验做完数据统计发现内容不够怎么办?在蛋白选择上,有木有做到以下几点。

如果你只有一个诱饵蛋白,做完筛选后,是否有继续将其结构域进行细分研究?

是否有向其互作基因的家族进行延伸研究?

是否有对其近缘物种或模式生物的相同基因进行比较研究?

例如在该文章中,作者对水稻基因OsPHO2 与OsTrxh1、 OsTrxh4是否有互作进行研究时,在构建载体时先使用了全长序列作为诱饵进行文库筛选,结果这两个基因被筛选到,显示互作。同时作者又克隆了Trxh家族的其他基因,与OsPHO2进行一对一验证。得到了OsPHO2 可以结合Trxh1和 Os Trxh4,但是不能结合 Os Trxh3/h5/h6/h7/h8/h10的结果。

从整个蛋白,进一步细化到功能域。作者将OsPHO2分成了N端(1-633 aa)和C端(589-876 aa)两部分,继续进行互作研究,确定其作用的具体位置(文中后半部分甚至细化到了蛋白的单个motif--WCGPC,在此不进行赘述)。

除了纵向研究水稻中PHO2与Trxh家族的互作关系外,作者还横向比较了拟南芥中At PHO2与 At Trxh2/h7/h8的互作关系。


第二,酵母双杂交体系是存在假阳性概率的。所以完整有说服力的研究是需要结合多种方法互相佐证的。比如BiFC,Co-IP,pull-down等蛋白互作方法。在该文中作者通过BiFC证明了OsPHO2-OsTrxhs在水稻原生质体中存在互作。通过pull-down证明了OsPHO2-OsTrxhs的体外互作。另外,在酵母双杂交体系中,有可能因为表达载体上的核定位信号或者细胞结构不同等原因,使原物种细胞中定位于不同时空的蛋白,在酵母细胞中表达后被拉到同一细胞核或相近位置中,由于空间上接近而产生假阳性互作。基于此,通过蛋白亚细胞定位研究,可以从空间上佐证蛋白互作的真实性。在该文章中,作者通过亚细胞定位发现,OsPHO2主要定位于ER,OsTrxh1 主要定位于细胞质、细胞核;OsTrxh4主要定位与细胞质和ER。另外通过引用相关文献报道的OsTrxh1 也会分泌到胞外,间接证明其来源于粗面ER。从空间上证明了蛋白互作的可能性。

最后,通过对所研究基因的野生型、突变型和互补型株系的基因表达量、生长形态、生理生化指标进行检测,使研究更接近于生产应用,也是极好的。该文章中检测了wild type Nipponbare (Nip), pho2 mutant,和complemented lines的叶片含磷量,对比分析了其生长形态差异,宏观上研究了OsPHO2的作用。最后的最后,在研究总结部分,一定不要忘记绘制信号通路图,意义你懂得。



·文献引用

Ying Y , Yue W , Wang S , et al. Two h-Type Thioredoxins Interact with the E2 Ubiquitin Conjugase PHO2 to Fine-Tune Phosphate Homeostasis in Rice[J]. Plant Physiology, 2017, 173(1):812.

友情提醒:做酵母双杂交,选欧易生物~

END

本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

欧易生物

技术热线:021-34781616 咨询热线:4006-4008-26

上海市闵行区新骏环路138号5幢3层
service@oebiotech.com
欧易生物
欧易生物微信公众号
沪ICP备-050455 网站地图  Copyright © 2016 上海欧易生物医学科技有限公司 保留所有权利