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P16的DNA异常甲基化抑制基因转录,促进癌细胞转移

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浏览:- 发布日期:2016-09-27 09:55:13【

P16的DNA甲基化对肿瘤转移的驱动作用

研究背景

前人研究报道,P16(又名CDKN62A或 Ink4a)的DNA甲基化在肿瘤发育过程中具有重要作用,并且该基因的遗传失活可以驱动肿瘤的生长和转移。但P16的DNA甲基化是否是肿瘤转移的驱动器仍未可知。在本研究中,利用P16特异的甲基转移酶(P16-dnmt)使P16基因失活,研究对肿瘤细胞的增值、迁移、侵袭的影响,从而确定P16的DNA甲基化对肿瘤转移的驱动器作用。

研究流程

样本取材

P16特异的甲基转移酶(P16-dnmt)载体转染各种细胞并进行相应技术分析。

研究技术

  • Western Blot

  • ChIP-Seq或ChIP-PCR

  • Illmina Methylation 450K array

研究过程

1.P16 的DNA甲基化直接抑制P16基因转录

为了确认P16的DNA甲基化的对该基因表达的影响,作者构建了P16特异的甲基转移酶载体(P16-dnmt),并转化细胞,Western Blot检测发现P16明显减少。为了排除位阻效应对P16表达的影响,作者构建P16的DNA甲基转移酶失活约80%的突变体(R822H),针对P16启动子区结合效率(ChIP-PCR技术)、P16的DNA甲基化状态和P16基因表达情况进行分析,发现P16的基因表达降低是由于甲基转移酶作用引起,而非位阻效应影响。

图:Western Blot分析P16-dnmtP16的影响

图:P16-dnmt和R882H突变体中对P16启动子区结合效率, P16的DNA甲基化状态及表达水平检测

为了验证甲基化是发生在P16启动子区的CpG岛上,作者构建了带有Tet-on开关的pTRIPZ慢病毒载体,同时利用 doxycycline处理,结果发现了P16的启动子区CpG岛高度甲基化和P16表达量极度降低。

图:P16-dnmt的pTRIPZ‘Tet-on’载体转染细胞后分析CpG甲基化情况和P16表达水平变化

为了进一步论证上述结果,课题组与上海欧易生物合作利用Illumina Methylation 450k array和CHIP-seq进行了检验,并结合生物信息学分析,获得了同样的结果。

图:Infinium Methylation 450K array和ChIP-seq针对P16甲基化状态分析

2. P16的DNA特异甲基化促进癌细胞迁移和侵袭

P16-dnmt 的pTRIPZ载体转染细胞后分析细胞的迁移能力和侵染能力,发现P16-dnmt 导致P16基因失活,进而增增强细胞的迁移和侵染能力。之后将转染后的细胞注入免疫缺陷的小鼠中,发现肺部重量增加,肿瘤区域扩大。

图:DNA甲基化异常引起的P16基因失活对癌细胞迁移能力和侵染能力的影响

图:DNA甲基化引起的P16基因失活对小鼠肺部重量和肿瘤区域大小的影响

为了确定以上结果,作者进行挽救实验,即在P16-dnmt的pTRIPZ载体转染的细胞中进行P16基因的超量表达,结果发现P16基因的超量表达反转了细胞迁移能力增加的现象。

图:P16基因的超量表达对P16-dnmt的pTRIPZ载体转染的细胞的细胞迁移能力影响分析

3. P16的特异DNA甲基化促进RB的磷酸化作用和上调NFKB的P65亚基表达

为了确定P16的DNA甲基化对下游通路的影响,作者通过Western Blot分析了P16-dnmt转染细胞在doxycycline处理下的变化,发现与无doxycycline处理相比,doxycycline处理下RB的磷酸化水平增加,NFKB的P65亚基表达上调。

注:在doxycycline处理下P16-dnmt转染细胞中RB磷酸化水平变化和NFKB的P65亚基表达变化

结论

P16的DNA启动子区的CpG甲基化,引起P16基因表达失活,进而促进癌细胞的增值、迁移和侵染能力,从而确定P16的DNA甲基化对肿瘤转移的驱动器作用。

参考文献:Chenghua Cui, Ying Gan,Liankun Gu,et al. P16-specific DNA methylation by engineered zinc finger methyltransferase inactivates gene tranion and promotes cancer metastasis. Genome Biology, 2015, 16(1): 252.

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