SEARCH
技术服务021-34781616

热门搜索关键词:转录组基因组甲基化酵母文库蛋白芯片

021-34781616

当前位置首页 » 新闻资讯 » 技术&解读&应用 » 【三代测序传】——三代建库

【三代测序传】——三代建库

返回列表 来源: 查看手机网址
扫一扫!【三代测序传】——三代建库扫一扫!
浏览:- 发布日期:2017-07-12 09:17:05【

技术流程

下图是三代基因组测序技术流程示意图:

下图是三代全长转录组测序技术流程示意图:

上机之前有样品准备和建库两个步骤,今天我们就来了解一下SMRT建库当中的内容。

SMRT 建库 文库制备

材料: 基因组 DNA,或者 cDNA,或者目标扩增产物; 片段化: 全基因组太大,仍然需要片段化,但因为测序读长很长,所以可以做成很大的 片段文库;

连接: 先把片段粘末端变成平端,两端分别连接环状单链:单链两端分别与双链正负链 连接上,得到一个类似哑铃(“套马环”)的结构,称为 SMRT Bell。连接半小时内完成。

引物退火 & 聚合酶结合

当引物与模板的单链环部位退火后,这个双链部位就可以结合到已固定在 ZWM 底部的 聚合酶上。

测序策略

万事俱备,一旦向反应中加入正常的离子,DNA 聚合反应开始了。模板双链打开成环 形,先合成正链,单链区,跟着合成负链。聚合酶每合成一圈,对于定向目标序列,就相当 于 2×覆盖度。由于合成产物和天然产物一致,聚合酶可以持续合成很长很长的产物,亦即 循环合成很多圈(重复多次),对于定向单分子目标序列来说就可以得到很高的覆盖度,即 获得很多 Subread,这就意味着可以对非常低的频率的片段获得很高的准确度,这称为环形 一致序列(Circle Consensus Sequence,CCS)模式,该模式适用于稀有突变及需要高精确度 的测序。这也是单分子测序能比 NGS 灵敏度更高地,高准确度地检测到稀有突变的原理。

基因组建库流程

全长转录组建库流程

PacBio Sequel 系统使用的全长转录组建库有 SMARTer? 和 Super? 两种方式。使用 Clontech 公司的 SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit 进行建库时,PolyA+RNA 最少需要 1 ng,总 RNA 最少需要 2 ng;采用 Life Technologies(旗下 Invitrogen)公司的 Super? Full-length cDNA Library Construction Kit 进行建库,建库时间至少是 SMARTer? 的两倍, PolyA+RNA 最少需要 10 µg。

相比前代 RS 系列测序仪,Sequel 系统在 SMRT Cell 片段长度偏好性方面已经有很大改 进,4 kb 以下的建库无需进行片段大小选择。目前 Sequel 系统一般采用 SMARTer? 建库方 式。经过我们对仪器和试剂的调试,也推荐效率更高的 SMARTer? 建库方式。当然,如果想 要追求更精准的研究结果,仍可采用分段建库的方式获得更好的测序结果,其流程可参考下 图:

一般而言,对于初步研究一个物种的转录组序列情况通常推荐三个 Cell 的数据量(6 G), 也就是建库片段长度 1 ~ 2 kb 一个 Cell、2 ~ 3 kb 一个 Cell 和 3 ~ 6 kb 测一个 Cell。当然也有一些高分文章测了几十个 Cell,此类文章中通常是对不同组织部位或者不同时间点的组织 进行测序,由此增加了测序所需的 Cell 数。数据量可以根据样本电泳情况调整,多倍体建议 数据量加大保证数据准确性。由于 3' UTR + 5' UTR 长度>1 kb,所以不构建<1 kb 文库。

?

根据三代测序的技术流程,建库之后就是上机测序了。下期小编将带来分析内容的介绍,敬请期待。

链接:【三代测序传】——伊始 · 测序技术简介

链接:【三代测序传】——Sequel背后的三代测序技术

链接:【三代测序传】——RS II的绝唱·三代最新起跑线

欧易生物

技术热线:021-34781616 咨询热线:4006-4008-26

上海市闵行区新骏环路138号5幢3层
service@oebiotech.com
欧易生物
欧易生物微信公众号
沪ICP备-050455 网站地图  Copyright © 2016 上海欧易生物医学科技有限公司 保留所有权利