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通过DUALmembrane酵母双杂交系统筛选APP互作蛋白

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浏览:- 发布日期:2016-11-29 09:12:16【

阿尔茨海默症(老年痴呆症,AD)是最常见的神经系统退行性疾病。随着人口老龄化的加重,该病越来越受到重视。然而,目前还没有能够取得根本性治疗的药物。发病机制尚不可知,其中淀粉样前体蛋白(Amyloid precursorprotein; APP)水解产物Amyloidβ(Aβ)蛋白为阿尔茨海默症发病首要原因的假说占主导地位。在细胞中APP通过信号传导,参与多个生物过程,研究其信号调节作用对多种生理疾病都有重要意义。

本研究中,以APP作为诱饵与Cub载体相连,猎物基因与NubG载体相连构成cDNA文库,通过分离泛素系统筛选互作蛋白。

实验材料:

酵母菌株:NMY51

诱饵载体:pBT3-C

cDNA文库:HumanBrain cDNA Library

实验方法:

DUALmembrane酵母双杂交;免疫共沉淀

实验结果:

1.APP阳性验证及筛选条件

根据实验要求,文中选择了SD-leu/trp/his/ade(7.5mM)作为APP筛选条件。

2.cDNA文库转化和互作子筛选

共筛选到15个阳性克隆见下图,值得注意的是,实验中在共转和筛选后发现有8个白斑在β-半乳糖苷酶检测中变蓝,说明其也与APP相互作用,作为候选的APP互作子测序后比对结果见下表。

3.在哺乳动物中STAU1与APP互作

通过免疫共沉淀技术验证了STAU1与APP在Hek293T细胞中相互作用。

4.STAU1降低了Hek293T细胞的存活率

免疫共沉淀实验中发现当STAU1转入细胞Hek293T中后,细胞存活率下降,进一步研究发现结果如下表。研究说明了APP和SATU1均能够降低哺乳类细胞存活率,推测APP可能参与RNA降解来降低细胞存活。

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参考文献:Yu Y, Li Y, Zhang Y.Screening of APP interaction proteins by DUALmembrane yeast two-hybridsystem.[J]. International Journal of Clinical & Experimental Pathology,2015, 8(3):2802-8.

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    【本文标签】:酵母双杂交 蛋白互作 膜体系酵母双杂 阿尔茨海默症 老年痴呆症 AD
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