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基本信息

论文题目: 

Alternative splicing regulation of doublesex gene by RNA-binding proteins in the silkworm Bombyx mori

发表期刊:RNA Biology

发表时间:2019.3

影响因子:5.216

合作单位:武汉大学

本文涉及的高通量技术酵母文库(欧易生物提供建库服务)/酵母三杂交

研究背景

作为重要的模式生物和经济昆虫,家蚕的性别决定一直是研究人员关注的热点。双性基因doublesex (dsx) 在基因转换器TRA1和TRA2的共同作用下产生可变剪切, 决定雌性特异基因产物DSXF或雄性特异基因产物DSXM的产生。因此,家蚕dsx基因是家蚕性别特异转录调节机制的双开关基因。但在家蚕中尚未发现TRA的同源体,dsx基因的可变剪切调控过程依然是未知的。

研究内容

作者利用酵母三杂交技术(yeast three-hybrid),筛选调控家蚕dsx基因第3和第4外显子剪切的RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)。结果表明,BxRBP1/Lark能够结合第3外显子,BxRBP2/TBPH和BxRBP3/Aret能够结合第4外显子。BxRBP3有四个转录本,其中三个转录本具有性别特异的表达模式。进一步研究发现,BxRBP1 和 BxRBP3直接互作,共同发挥剪切抑制子的功能。过量表达BxRBP1 和 BxRBP3,能够抑制雌性特异细胞中dsx基因第3和第4外显子的剪切,从而形成雄性特异基因产物。另外,作者证实了性别决定通路上游基因Masc调控BxRBP3的可变剪切。本文阐释了家蚕双性基因doublesex可变剪切调控机制,以及昆虫性别决定机制的分歧进化。

研究结果

1. 作者构建了家蚕雄性胚胎,雌性胚胎以及睾丸组织三个酵母文库,利用dsx基因的第3和第4外显子构建诱饵载体(pIIIA/MS2-2),分别进行酵母三杂交筛库。结果表明,BxRBP2在三个文库中都能够与dsx的第4外显子互作,而BxRBP1和 BxRBP3与第3和第4外显子的互作仅发生在睾丸文库中。以上互作都通过了质粒回转验证。序列分析结果显示,这三个基因在果蝇以及哺乳动物中都具有同源基因,并且编码蛋白包含多个RNA识别序列(RNA recognition motifs,RRMs)。

 

2. 为了获得上述三个基因的全长转录本及可变剪切序列,作者用雄性和雌性家蚕组织做了5'- 和3'-RACE。BxRBP1有三个转录本,其中两个较长的转录本编码相同的蛋白,并且具有两个RRMs和一个锌指结构域,较短的转录本不具有RNA结合功能。BxRBP2只有一个转录本,编码两个RRMs。BxRBP3有四个未报道的转录本,命名为BxRBP3-A, -B, -C 和 –D 。转录本A,B和C编码三个RRMs,而最短的转录本D缺少第一个RRM。

接下来,作者验证了这些转录本编码的蛋白对dsx基因外显子的结合能力。与前文酵母三杂交的结果一致,全长BxRBP1只能结合第3外显子,全长BxRBP2只能结合第4外显子。BxRBP3-A, -B和-C能够结合第4外显子,而BxRBP3-D不能结合第4外显子,说明第一个RRM对BxRBP3的活性具有重要作用。进一步的β-半乳糖苷酶活性检测结果表明,BxRBP3-A和-B具有相似的RNA结合能力,-C的结合能力下降40%左右,-D的结合能力完全丧失。

 

 

 

3. BxRBP1和BxRBP2在雄性及雌性组织中具有相似的表达水平,而BxRBP3-A, -B和-C具有性别偏好的表达模式。作者另外采用家蚕细胞系验证了这个结果。

 

4. 作者在雄性和雌性家蚕细胞系中检测三种蛋白对dsx基因可变剪切的调控。在雌性细胞系中,上游调控基因Masc能显著抑制dsx基因第3和第4外显子的剪切,而BxRBP3的四个异构体仅能微弱抑制上述外显子的剪切,产生雄性特异的可变剪切产物。相比之下,过量表达BxRBP1或者BxRBP2对dsx基因的可变剪切没有显著改变。值得注意的是,在雄性细胞系中dsx基因的可变剪切不受到任何RBP的调控。

作者进一步检测同时过量表达两个RBPs对可变剪切的影响。结果表明,BxRBP1能够显著提高BxRBP3对dsx基因外显子的剪切抑制,产生更多的雄性特异基因产物。其中BxRBP1与BxRBP3-B共同作用,能使65%的雌性特异基因产物转换为雄性特异产物。而BxRBP2不具备性别转换调控能力。

 

  

5. BxRBP1-3在昆虫和哺乳动物中都是高度保守的,但是在BxRBP2氨基酸序列上缺少N端的核定位信号(NLS)。因此作者采用EGFP融合蛋白检测BxRBP1-3在家蚕细胞系中的亚细胞定位。结果表明,BxRBP1,BxRBP3-B和BxRBP3-D主要定位在细胞核中,而BxRBP3-A和BxRBP3-C则主要定位在细胞质中。这个结果同样证实了BxRBP1与BxRBP3具有调控dsx基因外显子剪切的能力。

 

6. 那么BxRBP1与BxRBP3是否存在相互作用呢?酵母双杂交表明,BxRBP1能够与BxRBP3-B互作,与另外三个BxRBP3异构体互作很微弱。作者另外通过GST pull-down验证了上述结果。有文献报道,PSI和IMP能结合dsx基因的第4外显子,因此作者检测了二者与BxRBPs的互作关系。酵母双杂交表明,PSI能够与BxRBP3互作,而与BxRBP1和BxRBP2之间没有直接互作。另外,IMP与三个BxRBPs都没有互作。

 

 

7. Masc是一个具有锌指结构域的转录因子,作者在过量表达Masc和对照细胞系中分析了BxRBPs的表达水平。Masc促进了BxRBP3-A和-B的表达,而BxRBP3-C和-D的表达量没有明显变化。另外,BxRBP1和BxRBP2的也不受到Masc的调控。

 

 

8. 作者构建了包含dsx基因所有外显子以及截短内含子的可变剪接微型基因(mini-gene),检测Masc和BxRBPs是否能够直接调控dsx基因的可变剪切。在雌性家蚕细胞系中,dsx微型基因以雌性特异模式剪切。过量表达Masc能够有效抑制第3和第4外显子的剪切,产生雄性特异基因产物。过量表达BxRBP1或BxRBP3-B,能产生缺少第3或第4外显子的雌性特异基因产物。在人源HEK293T细胞系中,dsx微型基因被剪切成为两组相似的雌性特异基因产物,其中一组额外包含一段来自第4外显子的59nt片段。过量表达Masc不能抑制dsx微型基因第4外显子的剪切,表明Masc是家蚕特异的调控因子。然而,过量表达BxRBP3-B能够有效抑制第4外显子的剪切。

总 结

本文利用酵母三杂交技术,筛选到家蚕双性基因dsx第3和第4外显子的三个RNA结合蛋白,其中BxRBP1和BxRBP3直接参加靶基因的可变剪切,解析了家蚕性别决定调控机制。

参考文献

Zeng-Zhang Zheng, Xia Sun, Bei Zhang, Jia Pu, Ze-Yu Jiang, Muwang Li, Yu-Jie Fan & Yong-Zhen Xu (2019): Alternative splicing regulation of doublesex gene by RNA-binding proteins in the silkworm Bombyxmori, RNA Biology, DOI: 10.1080/15476286.2019.1590177

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本文系欧易生物原创

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