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项目文章 | 欧易客户发现lnc-C/EBPβ在髓源性抑制细胞中发挥免疫抑制的负调控作用

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浏览:- 发布日期:2018-09-19 14:17:28【


基本信息

论文题目:Lnc-C/EBPβ Negatively Regulates the Suppressive Function of Myeloid-derived Suppressor Cells

发表期刊:Cancer Immunology Research

发表时间(线上):2018.8.31

影响因子:9.188

作者单位:南开大学药物化学生物学国家重点实验室杨荣存教授课题组

本文涉及的高通量技术:基因芯片技术(Agilent Mouse miRNA Microarray v21.0、Agilent SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray,由欧易生物提供服务)

研究背景

髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)已成为一种癌症和其他病理条件下免疫反应的调节器,对先天免疫和获得性免疫反应均有抑制作用。目前发现炎症或肿瘤相关因子可能会影响MDSCs的发育,且MDSCs的分化和免疫抑制功能会可能受到microRNA和表观修饰因素的调控。同为noncoding RNA的lncRNAs在免疫细胞分化和功能的调控中也发挥者重要的作用,目前已经在多种髓源性的细胞中被研究。不过lncRNAs在MDSCs分化和细胞功能方面发挥的作用目前尚未研究清楚。

研究内容

MDSCs在癌症中可以发挥免疫抑制的功能,但lncRNAs在其中发挥的作用并不明确。研究者利用基因芯片发现了一种可能控制MDSCs免疫抑制功能的lncRNA,lnc-C/EBPβ。lnc-C/EBPβ在体内和体外均可被肿瘤和炎症环境诱导产生,它通过调节一系列目标转录本,例如Arg-2、NOS2、NOX2和COX2来控制MSDCs的免疫抑制功能和分化。lnc-C/EBPβ可以通过结合C/EBPβ的LIP异构体来抑制C/EBPβ的激活,后者正是免疫抑制时必需的转录因子。此外人的lnc-C/EBPβ也被证明有相同的负调控功能。以上结果表明,MDSCs中的lnc-C/EBPβ发挥对细胞的免疫抑制功能的负反馈调节的作用。

研究思路

图 | 研究思路图

研究结果

1. 利用基因芯片技术检测发现在GM-CSF+IL6诱导的MDSCs和仅GM-CSF诱导的MDSCs间有明显的lncRNAs差异表达,其中上调最明显的lncRNA是E130102H24Rik,在之后的部分被称为lnc-C/EBPβ(见图1 C)。这种lncRNA在多个物种间是保守的。使用5’RACE和3’RACE技术确定了位于4号染色体的小鼠lnc-C/EBPβ的长度(约含750个碱基)并用northern blot 验证。人的lnc-C/EBPβ则约含1000个碱基,位于1号染色体(见图1 E和F)。lnc-C/EBPβ主要位于细胞核(见图1G)且在人和小鼠中均缺乏蛋白编码能力。此外,利用qRT-PCR实验确定了炎症和肿瘤相关因子例如IL6会诱导MDSCs中lnc-C/EBPβ的表达(见图1 H-M)。

 

图1 | MDSCs中lnc-C/EBPβ的表达

C. qRT-PCR和RT-PCR验证lnc-C/EBPβ的表达变化;E. 小鼠lnc-C/EBPβ的长度确定(左)及验证(右);F. 人lnc-C/EBPβ的长度确定(左)及验证(右);G. 小鼠MDSCs(M-MDSCs)和人单核细胞(Hu-monocyte)中lnc-C/EBPβ的FISH结果;H和I. qRT-PCR检测暴露于不同细胞因子和肿瘤上清的MDSCs中lnc-C/EBPβ的表达水平。

 

2. 研究者在体外进行了lnc-C/EBPβ敲降和过表达实验并用基因芯片检测转录组水平的变化。芯片检测结果显示,在调节MDSCs免疫抑制功能中发挥作用的Arg-1、CYBB(NOX2)、 NOS2和ptgs2(COX2) 的表达水平在lnc-C/EBPβ敲降后均显著上调。而lnc-C/EBPβ过表达时这4个基因的表达均显著下调(见图2 A)。用qRT-PCR和免疫印迹实验验证了这一结果(见图2 B和C)。而这4个基因对应的代谢产物Arg-1、NO、H2O2和活性氧在敲降了lnc-C/EBPβ的MDSCs中含量更丰富,而在过表达lnc-C/EBPβ的MDSCs中含量降低(见图2 D-G)。与之前的研究一致,单核MDSCs(M-MDSCs)中Arg-1含量高,而多形核MDSCs(PMN-MDSCs)中含量高的则是H2O2(见图2 D-G)。敲降了lnc-C/EBPβ的MDSCs加到OT-Ⅰ-CD8+或OT-Ⅰ-CD4+中会显著减少CD4+T细胞和CD8+ T细胞中IFN-γ的产生,而过表达lnc-C/EBPβ会产生相反的结果(见图2 H和I)。

 

图2 | lnc-C/EBPβ对MDSCs的免疫抑制功能的负反馈作用(体外实验)

A.MDSCs中敲降(上)或过表达(下)lnc-C/EBPβ后表达谱芯片检测结果;B. qRT-PCR检测Arg-1、NOS2、 NOX2和COX2在不同处理后(左,敲降lnc-C/EBPβ,右,过表达lnc-C/EBPβ)的表达水平变化情况; D. Arg-1含量在敲降(左)或过表达(右)lnc-C/EBPβ后含量变化情况; H. 敲降lnc-C/EBPβ后在OT-Ⅰ CD4+ (左)或OT-Ⅱ CD8+ (右)细胞上清中IFN-γ的含量变化情况。

 

3. 之后使用两个小鼠移植瘤模型来研究lnc-C/EBPβ在肿瘤生长中的作用。通过尾静脉将转染了lnc-C/EBPβ shRNA或慢病毒的CD45.1+小鼠骨髓细胞注入到小鼠体内(见图3 A)。两种模型中,注射了转染了lnc-C/EBPβ shRNA的骨髓细胞的实验组的肿瘤生长被促进,与之相反的是注射的是lnc-C/EBPβ 慢病毒的骨髓细胞的小鼠,肿瘤生长变慢(见图3 B-G)。注射过转染了lnc-C/EBPβ shRNA的骨髓细胞的小鼠的肿瘤组织中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞占比减少,与之相反注射过转染了lnc-C/EBPβ慢病毒的骨髓细胞的小鼠这两类细胞占比升高(见图3 H和I)。分离出的CD4+ T细胞和CD8+T细胞上清中的IFN-γ变化趋势也同体外实验相同(见图3 J和K)。Ly6GlowLy6C+细胞和Ly6G+  Ly6C+ 细胞的比例在实验组与对照组间发生了明显的变化(见图3 L和M),这也暗示了lnc-C/EBPβ 阻碍MDSCs分化成M-MDSCs。

图3 | lnc-C/EBPβ对MDSCs的免疫抑制功能的负反馈作用(体内实验)

A.实验示意图;B-D. 小鼠黑色素瘤的生长曲线(B)、肿瘤大小(C)和瘤重(D)在尾静脉注了不同处理的细胞(lnc-C/EBPβ敲降或过表达)后的变化情况; H. 流式细胞术分析荷瘤小鼠在注射了获得或丧失功能的MDSCs后肿瘤组织中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的占比变化情况; J. 荷瘤小鼠肿瘤组织中分离出的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上清中的IFN-γ在注射了获得或丧失功能的MDSCs的变化情况; L. 流式细胞术分析了Ly6GlowLy6C+ 细胞和Ly6G +Ly6C+细胞的比例对荷瘤小鼠不同处理后的变化情况。

 

4. 利用RIP和pull-down技术,研究者确定了一系列在MDSCs的分化和免疫抑制功能方面发挥作用的转录因子中,lnc-C/EBPβ仅能同C/EBPβ的异构体LIP结合(见图4 A-C),而这种结合阻碍了C/EBPβ两种异构体LIP和LAP的分离(见图4 D和E)。研究者分析了Arg-1、NOS2、NOX2和 COX2的启动子区域,发现其均有潜在的C/EBPβ结合位点,并依次提出了一种可能的分子机制(见图 4 G)。之后使用CHIP-PCR方法确定了lnc-C/EBPβ同C/EBPβ LIP异构体的结合抑制了C/EBPβ LAP异构体的激活功能(见图4 H)。与此同时,通过监测加入IL6后不同时间4个基因和lnc-C/EBPβ的表达水平变化可知lnc-C/EBPβ对这4个基因的负调控作用(见图4 I)。

图4 | lnc-C/EBPβ同C/EBPβ LIP异构体结合抑制LAP的激活

A. RIP验证LIP与lnc-C/EBPβ的结合; D. HEK293T细胞中用免疫印迹技术检测LIP和LAP; G. lnc-C/EBPβ发挥负反馈作用可能的分子机制示意图; H. CHIP-PCR检测 Arg-1、NOS2、 NOX2和 COX2 启动子区域与C/EBPβ的结合情况; I. IL6处理后lnc-C/EBPβ和4个免疫抑制基因Arg-1、NOS2、 NOX2和 COX2的表达变化情况。

 

5. 确定了小鼠中lnc-C/EBPβ的功能后,研究者又确定了人lnc-C/EBPβ的功能。首先在人MDSC样细胞中敲降lnc-C/EBPβ后Arg-1、NOS2、 NOX2和 COX2 4个基因的表达变化趋势与小鼠中的结果相同(见图5 A和B)。之后在人的结肠炎、腺癌组织中利用RNA-FISH和免疫染色证明了CD11b+的单核细胞、巨噬细胞中有lnc-C/EBPβ的表达(见图5 C和D)。从结肠癌病人血液中分离出的表型为CD3-HLA-DR-CD33+CD11b+的MDSCs中lnc-C/EBPβ表达水平相对正常人更高而RNA-FISH也证明了表型为CD3-HLA-DR-CD33+CD11b+的MDSCs中lnc-C/EBPβ表达(见图5 E-H)。

图5 | 人lnc-C/EBPβ同小鼠lnc-C/EBPβ功能相似

A.qRT-PCR检测人MDSC样细胞敲降lnc-C/EBPβ后Arg-1、NOS2、 NOX2和 COX2 4个基因的表达变化趋势; C. 人结直肠癌和癌旁组织中进行免疫染色和RNA-FISH结果; E. 流式细胞术检测CD3-HLA-DR-CD33+CD11b+MDSCs在结肠癌和直肠癌患者及健康个体中的水平; H. 结肠癌病人外周血中CD3-HLA-DR-CD33+CD11b+ MDSCs的免疫染色和RNA-FISH结果。

 

总结

本文通过基因芯片技术,筛选得到了上调最显著的一个lncRNA,lnc-C/EBPβ。之后研究者从体内和体外两个角度证明了lnc-C/EBPβ在MDSCs中可被炎症和肿瘤环境诱导表达,并可以发挥对MDSCs的免疫抑制功能的负调控作用。lnc-C/EBPβ的作用机制是通过同C/EBPβ LIP异构体的结合抑制了C/EBPβ的激活,进而影响下游基因的表达。作为一个调节因子,lnc-C/EBPβ使MDSCs的免疫抑制功能可以受到胞外炎症和肿瘤相关信号的控制。lnc-C/EBPβ的负调控作用也使它成为一种潜在的治疗靶点。

参考文献

Yunhuan Gao, Wei Sun, Wencong Shang, et al. Lnc-C/EBPβ Negatively Regulates the Suppressive Function of Myeloid-derived Suppressor Cells. Cancer Immunology Research. DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0108.

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本文系欧易生物原创

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