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项目文章 | 欧易客户发现RALF1信号转导中EBP1负向调控作用的分子机制

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浏览:- 发布日期:2018-10-26 17:44:19【

基本信息

论文题目:EBP1 nuclear accumulation negatively feeds back on FERONIA-mediated RALF1 signaling

EBP1的细胞核内积累负向作用于FERONIA调节的RALF1信号转导

发表期刊PLOS Biology

发表时间:2018.10

影响因子:9.163

作者单位:湖南大学于峰教授

本文涉及的高通量技术:RNA-seq(由上海欧易生物提供服务)

 

研究背景

FERONIA (FER) 是细胞膜表面受体蛋白激酶,作为 RALF1 多肽信号的受体,可通过胞外域与 RALF1 直接结合来感受 RALF1 信号刺激并将该信号传递至细胞内,驱动一系列下游反应,包括抑制细胞质膜表面的氢泵活性(Arabidopsis H+-ATPase 2,AHA2)和调控细胞核内基因表达,来控制细胞生长,但其机制尚不清楚。

研究内容

本研究发现,通过与 RALF1 结合,FER 首先提高 ErbB3 结合蛋白1基因(ErbB3-binding protein 1,EBP1)的 mRNA 的转录本水平,并使得 EBP1 蛋白发生磷酸化和 EBP1 的细胞核内积累。EBP1 与先前鉴定的 RALF1 调控基因(如CML38)结合,来调控这些基因的转录,响应 RALF1 信号转导,形成 RALF1-FER-EBP1 的反应轴线。研究还发现 EBP1 能够抑制 RALF1 的多肽反应,形成转录本-翻译反馈回路(Transcription–translation feedback loop,TTFL)。

研究思路

研究结果

1.RALF1-FER 促进 EBP1 的 mRNA 转录,导致 EBP1 蛋白水平增加

Western blot 实验发现,RALF1 促进了 EBP 1蛋白的积累,且具有 FER 依赖性。通过 qPCR 发现,EBP1 mRNA 的表达量(转录水平上)并未受到 RALF1 的显著影响,而是通过某种机制和转录后调控相关。接着作者又利用 Polysome profiling 分析发现,RALF1 对EBP1 mRNA 翻译的促进作用取决于 FER,用环己酰亚胺(cycloheximide,CHX,一种mRNA翻译阻碍因子)阻碍蛋白的合成,发现 EBP1 不再积累。以上实验说明,RALF1 能够通过改变 EBP1 mRNA 的翻译,影响EBP1蛋白的积累。

 

图 |(A)经 RALF1 处理后的 Col-0 和 fer-4 两个植物实验组EBP1积累的时间过程,Actin 为对照组;(B-F)Polysome profiling 和 qRT-PC R分析EBP1 和 EIF4A1 mRNA 的翻译状态;(H)RALF1 (1 μM for 2 hours) 使 EBP1 mRNA 的翻译,CHX 作用后 EBP1 不再积累,Actin 为对照组

2.EBP1在核内积累和发生磷酸化

利用免疫印迹分析和免疫荧光检验分析,证明了 EBP1 在细胞核内积累。构建了一个脱落酸(ABA)诱导的体外磷酸化系统,分析得出EBP1是FER的磷酸化底物,受到 FER 激酶的作用而发生磷酸化,并进一步确定了 EBP1 的 10 个磷酸化位点。

图 | (A)EBP1 体外磷酸化分析。结果显示了磷酸化和去磷酸化的 FER-KD-S 和 EBP1-His;(B)EBP1 磷酸化分析,检测得到 FER 的磷酸化水平,pSer 和 pThr 抗体用于发现磷酸化 EBP1

3.EBP1对RALF1多肽信号传导产生负向调控作用

基于 fer-4,ebp1,EBP1-GFP 和 EBP1-OE 等基因的突变型和野生型,作者进行了多个 RALF1 多肽反应分析,观察对 RALF1 的敏感性,并通过 qRT-PCR 检测 FER 的相对表达水平。结果说明,EBP1 对 RALF1-FER 信号通路发挥下调作用,对 RALF1 应答产生负向调控作用。

图 | EBP1 抑制 RALF1 多肽应答。不同字母的值之间有显著差异(p < 0.05),采用的检测方法是 ANOVA

4.EBP1 与基因的启动子结合来调控基因表达

作者选取 Col-0 (经 RALF1 处理和未处理)、ebp1-1 和 fer-4 四个组,通过RNA 测序,检测 EBP1 调控基因的表达水平,并用 DAVID 对差异表达基因进行功能注释,发现了与信号转导、转录事件和应激性反应等有关的共有基因,EBP1通过调控这里面的基因作用于 RALF1-FE R信号转导通路。利用 ChIP 实验和 qPCR 分析,得到了 RALF1 处理促进 EBP 1结合的四个基因(CML38、CKX4、ERF1B和SAUR9)。对 CML38 进一步分析,利用电泳迁移率变动分析,证实了 EBP1 蛋白和 CML38 结合的 motif 区域。通过双荧光素酶测定,证明了在 RALF1 信号转导中 EBP1 抑制了 CML38 的 mRNA 的表达水平,从而调控 CML38 的表达。

图 | RALF1-FER-EBP1 信号通路调控基因的表达。(A、B)Venn 图展示了 ebp1-1 和 fer-4 突变体上调和下调的差异表达基因数;(C)Venn 图展示了 EBP1-,FER-和 RALF1 调控基因的总数和共有基因数;(D)ChIP 实验得到了和 EBP1 结合的 CML38 的启动子;(E)竞争性 EMSA 展示了与 EBP1 结合的 “CCACGTC” motif 区域;(F)Dual-LUC 实验证明了 EBP1 抑制了 CML38 的 mRNA 的表达量

 

总结

RALF1-FER 信号转导提高了 EBP1 蛋白的表达水平,EBP1 在细胞核内积累和磷酸化。EBP1 和 RALF1-FER 调控基因的启动子区域结合,抑制基因的表达,在 RALF1-FER 信号转导中发挥负向调控作用。

 

参考文献

Li C, Liu X, Qiang X, Li X, Li X, Zhu S, et al. (2018) EBP1 nuclear accumulation negatively feeds back on FERONIA-mediated RALF1 signaling. PLoS Biol 16(10): e2006340. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006340.

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本文系欧易生物原创

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