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项目文章 | 欧易客户通过miRNA芯片技术发现外泌体途径诱导上皮性卵巢癌发展的作用机制

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浏览:- 发布日期:2018-11-20 10:23:13【

基本信息

论文题目:Exosomes released from tumor-associated macrophages transfer miRNAs that induce a Treg/Th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer

发表期刊:Cancer Immunology Research

发表时间:2018.11

影响因子:9.188

通讯作者:上海交大医学院 汪希鹏教授、林盈盈博士

本文涉及的高通量技术:安捷伦miRNA芯片(由欧易生物提供服务)

研究背景

免疫微环境由肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和T淋巴细胞组成,后者包括调节性T细胞(Tregs)和T细胞助手17细胞(Th17),免疫微环境对上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)的发展具有重要作用。Treg/Th17细胞不平衡与系统性红斑狼疮、糖尿病、肿瘤等多种疾病有关。研究发现TAMs能够产生外泌体作用于微环境中毗邻的细胞,但是EOC免疫微环境中外泌体及其转运的miRNA的具体功能和作用机制仍是未知的。

研究内容

基于TAMs细胞来源的外泌体miRNA芯片分析,作者发现了miR-29a-3p和miR-21-5p高表达。将两种类型的miRNA mimics转染到CD4+ T细胞,发现其抑制STAT3的表达,并造成Treg/Th17失衡。

结果表明,外泌体能够调节TAMs细胞和T细胞的相互作用,产生的免疫抑制性微环境能够促进EOC肿瘤细胞的生长和转移。分析TAMs细胞来源的外泌体及其相关miRNA能够为EOC新的治疗方法奠定基础。

 

研究思路

研究结果

1.EOC患者组织中Treg/Th17发生了上调

选取124个EOC患者和26个良性卵巢肿瘤患者的卵巢组织样本,通过免疫荧光检验发现与良性卵巢肿瘤患者相比,EOC患者的初期肿瘤组织和转移性腹膜组织Treg/Th17均显著升高。



图1 |(E)EOC组织(n=124)和良性卵巢肿瘤组织(n=26)Treg/Th17的比率对比;EOC腹膜组织(n=15)和良性腹膜组织(n=6)Treg/Th17的比率对比

2.Treg/Th17失衡对卵巢肿瘤生长和转移的影响

利用ID8细胞系构建转移性卵巢癌C57BL/6模型,体内实验发现Treg/Th17的比率升高能够促进肿瘤细胞的生长,也能够促进肿瘤细胞的转移。

图2 |(C)向C57BL/6小鼠腹腔内注射ID8-Luc-pur细胞,用荧光成像系统发现高Treg/Th17比率能够显著增加肿瘤的载量;(G)用伊红(Hematoxylin-eosin)对肿瘤细胞进行染色,实时成像后发现肿瘤细胞遍布整个腹腔

3.M2巨噬细胞产生的外泌体能够诱导Treg/Th17失衡

诱导TAM分化成M1和M2两种类型的巨噬细胞,未处理的巨噬细胞作为对照,分别与CD4+ T细胞进行共培养,发现TAMs细胞能够诱导Treg/Th17的失衡。各自分离外泌体后再次与CD4+ T细胞进行共培养,发现TAMs细胞产生的外泌体能够诱导Treg/Th17失衡。



图3 |(B)三组中Treg/Th17的比率;(F)三组巨噬细胞分离得到的外泌体分别与CD4+ T细胞共培养三天,Th17和Treg细胞的比例通过流式细胞分析确定,并计算Treg/Th17

4.外泌体miRNAs通过靶向STAT3来诱导Tregs/Th17失衡

安捷伦miRNA芯片分析发现,M2巨噬细胞分泌的外泌体中有42个miRNAs发生了上调和10个miRNAs发生了下调,其中有五个上调miRNAs和一个下调miRNAs与T细胞分化有关。将miRNA mimics转染到CD4+ T细胞,发现只有hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p能够改变Tregs/Th17。

Western blots和RT-PCR分析发现过表达hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p导致CD4+ T细胞的STAT3蛋白及其mRNA都发生下调。RT-PCR和流式细胞检测分析进一步发现,细胞因子IL4、IL6和TNFα下调,抗炎细胞因子TGFβ和IL10上调。以上因素造成EOC肿瘤微环境失衡,最终导致肿瘤的发展。



图4 |(A)THP-1和THP-1诱导得到的M2巨噬细胞分泌的外泌体中miRNA表达Heatmap图;(B)和T细胞分化相关的miRNA;(D)将Hsa-miR-21-5p和hsa-miR-29a-3p mimics转染到CD4+ T细胞,流式细胞检测Th17和Treg细胞的比例,并计算Treg/Th17;(E)Western blot观察Th17和Treg细胞STAT3蛋白表达量;(G)RT-PCR观察Th17和Treg细胞STAT3 mRNA的表达量;(J-K)CD4+ T细胞受到hsa-miR-21-5p和hsa-miR-29a-3p mimic转染或敲降后,Tregs细胞因子TGFβ、IL10和IL4以及Th17细胞因子TNFα和IL6的表达量

5.mmu-miR-29a-3p和mmu-miR-21-5p对卵巢肿瘤转移的影响

向小鼠腹腔注射ID8-Luc-pur细胞,再次构建转移性卵巢癌C57BL/6模型,利用生物成像系统观察肿瘤的生长情况,发现mmu-miR-21-5p-mimic和mmu-miR-29a-3p-mimic组肿瘤载量显著增加。收集小鼠的腹膜、肠系膜和膈膜,利用实时成像技术观察肿瘤的转移情况,发现mmu-miR-29a-3p和mmu-miR-21-5p能够促进肿瘤的生长和转移。

图5 |(C)向小鼠腹腔注射ID8-Luc-pur细胞,10周后利用生物成像系统检测肿瘤细胞的荧光强度(cps);(F)10周后小鼠腹腔的成像情况

6.Treg/Th17失衡与EOC分级和患者存活率有关

利用ROC曲线比较Treg/Th17在EOC患者中的灵敏性和特异性,Treg/Th17对临床上EOC患者的总生存率具有很好的预测价值。利用TCGA数据库分析Treg/Th17和EOC患者的相互关系,得出Treg/Th17与EOC的组织学分级有关,并且是一个独立的预后指标。

图6 |(A)ROC曲线反映Treg/Th17比率在EOC患者中的灵敏性和特异性;(B)基于Treg/Th17不同比率(大于1.02和小于1.02)的EOC患者存活率情况;(C)TCGA数据库中467个EOC患者的Treg/Th17和总生存率(OS)的关系;(D)TCGA数据库中467个EOC患者miR-29a-3p和miR-21-5p表达量与OS的关系

总结

来自TAMs的外泌体向CD4+ T细胞转运hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p,通过直接靶向STAT3,导致Treg/Th17失衡,诱导EOC肿瘤的生长和转移。

图7 | TAMs通过外泌体诱导EOC肿瘤发展的途径

 

参考文献

Zhou J, Li X, Wu X, et al., (2018). Exosomes released from tumor-associated macrophages transfer miRNAs that induce a Treg/Th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer. Cancer Immunology Research. doi: 10.1158/2326-6066.cir-17-0479

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本文系欧易生物原创

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