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项目文章 | 欧易生物助力复旦大学在植物避荫反应调控机制方面取得新进展

文章出处:   责任编辑:   发布时间:2018-10-08 15:59:31    点击数:-   【

论文题目

Shade-induced nuclear localization of PIF7 is regulated by phosphorylation and 14-3-3 proteins in Arabidopsis

遮荫诱导的拟南芥核定位蛋白PIF7受磷酸化及14-3-3调控

发表期刊:eLife

发表时间:2018.6

影响因子:7.616

作者单位:复旦大学遗传工程国家

重点实验室李琳研究员课题组

本文涉及的高通量技术:酵母双杂交筛库(由欧易生物提供服务)和LC-MS/MS

研究背景

植物避荫反应(Shade Avoidance Syndrome,SAS)是指细胞内各种形式的光信号受体相互作用,在感受到植物被遮荫后引起茎秆伸长的反应。避荫反应可使植物在密植条件下最大限度地获得光照, 提高个体在群体中的生存能力。已有的研究表明SAS受到表观修饰的调控,但其分子机制仍不甚清楚。

研究内容

拟南芥中,去磷酸化转录因子PIF7(光敏色素作用因子)是联结光受体与茎秆伸长的关键因子。

研究者发现,避荫反应能诱导PIF7的去磷酸化及其在细胞核中的积累。磷酸化位点突变之后,导致PIF7在核内的积累增加以及避荫响应基因表达量的升高,进而导致下胚轴伸长。进一步通过酵母双杂交技术,筛选到互作蛋白14-3-3。阻断PIF7和14-3-3的互作,或者降低14-3-3的表达水平,能够加速遮荫处理后PIF7的核定位以及去磷酸化,并且增强遮荫表型。相反,过量表达14-3-3能够弱化遮荫表型。

以上结果表明:当植物处于避荫状态,PIF7的移动依赖其自身磷酸化水平,并揭示了14-3-3抑制避荫反应的新机制。

研究思路

研究结果

1. 构建35S::GFP-PIF7转基因植株,检测遮荫处理前后的GFP信号变化。当植物处于遮荫状态,GFP-PIF7会加速在细胞核中的积累。分离亚细胞组分进行western blot 检测,表明PIF7由细胞质向细胞核迁移。

2. 构建酵母文库,通过双杂交筛选PIF7的互作蛋白。一共筛选到6个14-3-3家族蛋白。进一步通过BiFC和pull-down验证了蛋白之间的互作。另外Co-IP实验表明,白光培养的植株中PIF7能够与14-3-3互作,原因可能是PIF7的磷酸化依赖光诱导。

3. 利用LC-MS/MS,检测到PIF7的磷酸化位点S139和S141。另外,通过生物信息学预测得到另外三个磷酸化位点S78, S80和S125。构建不同程度的点突变,评估磷酸化位点对PIF7互作能力的影响。酵母双杂交实验表明,磷酸化位点的突变削弱了PIF7和14-3-3的互作。进一步通过BiFC, pull-down和Co-IP验证了上述结果。

4. 构建磷酸化位点突变的35S::GFP-PIF7载体,转化烟草叶片。结果表明,点突变蛋白检测出很强的核定位信号,而野生型PIF7在细胞核和细胞质均有定位。再进行遮荫处理,发现野生型PIF7从细胞质到细胞核迁移,而对点突变蛋白的影响很小。利用转基因材料进行体内实验,也得到了同样的结果。进一步分离亚细胞组分,检测蛋白的定位。点突变蛋白PIF7(2A)只在细胞核中能检测到,而野生型蛋白类似物PIF7(2D)主要定位于细胞质中。

利用荧光定量PCR检测转基因植株中遮荫响应基因的表达情况。过量表达PIF7(2A)提高了PIF7下游基因IAA19和YUCCA8的表达,并导致下胚轴伸长。

5. 利用抑制剂R18阻断PIF7与14-3-3之间的互作,发现PIF7在细胞核中的积累加速。进行遮荫处理2分钟后,在14-3-3 λk双突变体中,能观察到更多的PIF7蛋白在细胞核中积累,磷酸化的PIF7蛋白消失速度也更快。

这个结果表明,14-3-3有助于PIF7在细胞质内的滞留。

6. 利用R18对转基因植株进行处理,能够促进下胚轴的伸长以及IAA19和YUCCA8的表达。而对pif7-1突变体进行处理,没有明显的改变。14-3-3的单突变体和双突变体均表现出增强的遮荫响应,而过量表达14-3-3表现为减弱的遮荫响应。

以上结果表明,14-3-3通过PIF7对植物遮荫响应发挥负调控的作用。

总结

PIF7作为光敏色素相互作用因子,是一种可以与光受体光敏色素蛋白相互作用的bHLH家族转录因子。

利用酵母双杂交筛库,能够迅速锁定目标蛋白,进而通过转录调控,修饰等途径挖掘互作蛋白作用机理,揭示生物学过程的本质。

参考文献

Huang, X. and Q. Zhang, et al. (2018). Shade-induced nuclear localization of PIF7 is regulated by phosphorylation and 14-3-3 proteins in

Arabidopsis. eLife 7: e31636.

原文链接

https://elifesciences.org/articles/31636

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本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

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