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项目文章 | SCIENCE子刊:茉莉酮酸调控青蒿素合成机制

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浏览:- 发布日期:2018-11-27 18:11:03【

基本信息

论文题目:Jasmonate promotes artemisinin biosynthesis by activating the TCP14-ORA complex in Artemisia annua

发表期刊:SCIENCE ADVANCES

发表时间:2018.11

影响因子:11.511

作者单位:上海交通大学唐克轩教授课题组

本文涉及的高通量技术:酵母双杂交文库(由欧易生物提供服务)

研究背景

青蒿素及其衍生物(蒿甲醚和青蒿酯)是效果最好、见效最快的抗疟药。黄花蒿是青蒿素的唯一天然原料。然而,青蒿素主要合成和积累于叶片表面的分泌型腺毛,但其干重只占黄青蒿干重的0.01%-1%。目前,利用工程酵母进行青蒿素的半合成生产产量十分有限,黄花蒿依然是青蒿素最主要的来源。因此开展青蒿素合成通路转录调控网络的研究,利用代谢工程手段提高青蒿素的含量已成为全球研究的热点。

研究内容

研究人员通过酵母双杂交筛库发现,黄花蒿腺毛特异表达的AaORA能够与AaTCP14相互作用,共同结合并激活青蒿素合成途径的两个关键基因双键还原酶2(DBR2)和醛脱氢酶1(ALDH1)的启动子。进一步,研究人员通过酵母三杂交,荧光素酶互补实验等技术发现,茉莉酮酸信号通路抑制子AaJAZ8通过与AaTCP14和AaORA互作,从而抑制AaTCP14-AaORA复合体对DBR2启动子的激活能力。相反,茉莉酮酸处理诱导的AaJAZ8降解,能够解除对AaTCP14-AaORA复合体的抑制,促进青蒿素的合成。

本文研究阐明了茉莉酮酸激活AaTCP14-AaORA复合体,调控青蒿素合成的新机制。

研究思路



研究结果

1.AaORA能够在体内激活青蒿素合成途径四个关键基因ADS, CYP71AV1, DBR2和 ALDH1,而酵母单杂交实验无法验证AaORA与这四个启动子的互作。这个结果表明AaORA可能与其他转录因子互作,行使其转录激活功能。

利用没有自激活功能的AaORA蛋白C端作为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛选,得到潜在的互作蛋白AaTCP14。进一步通过酵母双杂一对一实验,GST pull-down,BiFC和Co-IP进行验证。

2. 利用qRT-PCR研究AaTCP14的时空表达,发现AaTCP14在嫩叶中大量表达,并且随着叶片的发育表达量逐渐降低。这种表达模式与AaORA以及其他青蒿素合成基因相似。另外,AaTCP14在腺毛,幼苗,花以及花苞中高表达,而在根中表达量较低。进一步检测AaTCP14启动子的组织特异表达,表明其在非分泌型(TST)和分泌型(GST)腺毛中定位。

AaORA受到茉莉酸甲酯的诱导,并且在处理9小时后达到峰值。QRT-PCR结果表明,AaTCP14在的表达水平同样在茉莉酸甲酯处理9小时后达到峰值。因此,AaORA和AaTCP14在响应茉莉酸甲酯处理后具有相似的表达模式,并且能够诱导青蒿素合成。另外,作为一个转录因子,亚细胞定位实验显示TCP14位于细胞核中。


3.在黄花蒿中过量表达AaTCP14,发现青蒿素相关基因(ADS, CYP71AV1, DBR2和ALDH1)以及茉莉酮酸通路相关基因(AaAOC 和AaOPR3)的表达量同样显著上调,提示TCP14可能激活青蒿素相关基因的表达,并提高青蒿素产量。研究人员通过HPLC证实,在AaTCP14过量表达植株中,青蒿素和二氢青蒿酸的含量相比野生型植株分别提高80-120%和10-120%,而青蒿酸含量降低45-69%。进一步,构建AaTCP14反义表达转基因植株,使得上述青蒿素及茉莉酮酸相关基因的表达量显著降低。同时,青蒿素,二氢青蒿酸和青蒿酸的含量分别降低19-25%,20-72%和11-37%。以上结果表明,AaTCP14是青蒿素合成途径的激活因子,可以作为遗传工程的靶点提高黄花蒿的青蒿素产量。

4.利用双荧光素酶报告实验证明,AaTCP14可以激活DBR2和ALDH1的表达。另外,通过酵母单杂交证明,AaTCP14能够结合DBR2和ALDH1启动子上的TCP结合位点(TBS)。进一步,研究人员通过EMSA验证了AaTCP14与二者在体外的结合。

5.双荧光素酶报告实验表明,AaTCP14和AaORA都能激活DBR2和ALDH1的启动子,并且二者协同工作能显著提高对靶基因的激活能力。值得注意的是,茉莉酮酸甲酯处理能提高AaTCP14和AaORA的转录激活能力。以上结果说明,AaORA能够通过与AaTCP14的互作提高其转录激活能力,并且这种协同工作受到茉莉酮酸甲酯的诱导。

为了阐明AaTCP14-AaORA复合体对青蒿素合成的作用,研究人员构建了过量表达AaTCP14和AaORA的黄花蒿转基因植株。DBR2和ALDH1的表达量都有显著提高,在体内证明了AaTCP14-AaORA对二者的调控功能。HPLC分析表明,青蒿素,二氢青蒿酸和青蒿酸的含量相比野生型植株有了明显升高,同时转基因植株没有其他明显的表型。

研究人员进一步构建AaORA的过量表达和沉默转基因植株,表明AaTCP14和AaORA在转录水平的表达是相互独立的。



6.AaJAZ8茉莉酮酸信号通路的负调控因子,能够抑制青蒿素的合成。酵母双杂交,BiFC,荧光素酶互补实验和Co-IP证实,AaJAZ8可以分别与AaTCP14和AaORA互作。进一步通过共定位实验证实,AaJAZ8,AaTCP14和AaORA定位在相同的核体中。另外发现,AaMYC2能够与其他AaJAZ蛋白(AaJAZ5, AaJAZ6, AaJAZ8和AaJAZ9)互作。



7.为了阐明AaJAZ8能否调控AaTCP14与AaORA的互作,研究人员采用了酵母三杂交和荧光素酶互补实验。结果表明,AaJAZ8抑制了AaTCP14与AaORA的互作。进一步通过分段克隆进行酵母双杂交,确认了AaJAZ8能够与AaORA竞争结合AaTCP14的C端,并阻止AaTCP14与AaORA的互作。

此外,研究人员通过双荧光素酶报告实验,发现AaJAZ8能够显著减弱AaTCP14-AaORA复合体对靶基因DBR2的转录激活能力,并且这种抑制作用可以被茉莉酮酸甲酯补救。

总结

酵母单,双,三杂交完美结合, 揭示AaTCP14-AaORA复合体与青蒿素合成调控因子MYC2,GSW1和JAZ8的相互关系,阐明茉莉酮酸调控青蒿素生物合成新机制。

参考文献

Ya-Nan Ma and Dong-Bei Xu et al. (2018). Jasmonate promotes artemisinin biosynthesis by activating the TCP14-ORA complex in Artemisia annua. SCIENCE ADVANCES https://doi.org/10.1126/sciadv.aas9357.

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本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物


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