欧易生物

热门搜索关键词:转录组基因组甲基化酵母文库蛋白芯片

021-34781616

联系欧易

服务热线:021-34781616
  • 客服QQ:1019235790
  • 邮箱:market@oebiotech.com
  • 公司地址:上海市闵行区浦江镇新骏环路138号5幢3层

简化基因组测序2b-RAD

简化基因组测序2b-RAD特点


2b-RAD技术(Wang et al, Nat. Methods, 2012)是指基于IIB型限制性核酸内切酶的简化基因组测序技术。通过对IIB型内切酶酶切基因组产生的等长tag进行高通量测序,可以大幅降低基因组 的复杂度,同时不受有无参考基因组的限制,快速进行全基因组范围内大规模SNP标记的开发与分型。与传统的简化基因组技术RAD-Seq相比,2b- RAD技术获得的标记数目更多、分型准确率更高,可用于高密度遗传图谱构建、QTL定位、全基因组关联分析、群体进化研究、辅助基因组的组装、全基因组选 择育种等。


欧易特色


● 不经过片段大小选择,技术重复度好 

● 具有极强的灵活性,标签数目多少可控

● 标签长度一致,PCR时具有一致的扩增效率 

● 根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案

● 共显性标记之外还可以开发显性标记

● 基于混合泊松分布模型的de novo SNP分型算法iML,有效去除重复序列对分型的干扰


简化基因组测序2b-RAD项目流程


2brad流程


数据分析内容


标准数据分析

● 数据质控  ● 2b-RAD tag产出统计

● 基于iML算法的SNP分型  ·有参:与参考基因组比对 ·无参:个体及群体标签聚类

SNP位点注释(基于参考序列的注释信息)


高级数据分析

● 遗传连锁图谱构建   ● QTL定位

● 群体遗传结构分析 ● 关联分析

● 群体进化研究 ·群体遗传多样性指数计算 ·主成分分析(PCA)·群体遗传多样性指数计算 ·主成分分析(PCA)


推荐测序模式


● Hiseq X-Ten, PE150 

● 4 M reads/1 G基因组大小


简化基因组测序2b-RAD样品要求


● DNA总量≥1 μg, OD260/280为1.8-2.0

● 请提供每个样品具体的浓度、体积、提取时间,同时附上电泳检测胶图、分光光度计或者Nanodrop仪器检测数据等

● 适用范围:单倍体或二倍体物种(有无参考基因组皆可)

● 群体进化研究:群体或亚群的划分要非常明确,群体或亚群内个体的选择要具有代表性

● 遗传图谱构建:群体类型(F1、F2、DH、RIL等);群体数量不少于100个个体


常见问题


● 1. 2b-RAD技术中所用的是一种什么类型的酶?这种酶有什么特性?如何进行选择?
2b-RAD所使用的IIB型限制性核酸内切酶是一类商业化的酶,这种IIB型的酶在基因组上识别特定的碱基序列(一般为5-7碱基),然后在识别位点两 侧进行双链酶切,全基因组范围内切出的标签片段长度相等(如:内切酶BsaXI切出等长的33 bp片段)。针对有参物种,可通过对基因组进行电子酶切结合预期的标签数确定合适的酶,对于无参物种则可选用其近缘物种基因组序列进行电子酶切。


● 2. 2b-RAD标签平均测序深度是多少?
为了保证分型结果的可靠性,特别是杂合位点,2b-RAD标签平均测序深度都会控制在15X以上。


● 3. 如何调整标签密度?
2b-RAD技术既可以增加标签密度,也可以降低标签密度。
增大密度:通过电子酶切选用酶切识别位点较多的酶,也可同时使用两种或两种以上的IIB型酶进行建库;
降低密度:IIB型内切酶酶切后产生的片段为粘性末端,并且粘性末端的碱基是随机的。

因此,在对酶切片段连接接头的过程中,可通过选择性接头特异地选择部分标签进行连接建库,以达到降低密度的目的。


案例展示


案例一:遗传图谱——简化基因组测序2b-RAD构建水产生物精度最高遗传图谱并进行QTL定位

研究背景:

受全球气候变暖的影响,珊瑚表现出对高温的适应能力。人们一直认为对高温的生理适应而不是遗传适应,在珊瑚响应气候变化方面发挥主导作用。


研究内容:

本文以鹿角珊瑚(Acropora millepora)为研究对象,采用简化基因组测序2b-RAD技术构建其遗传连锁图谱,并成功对耐热基因进行了定位。证明珊瑚的耐热性是可遗传的,而且这种适应是来源于珊瑚群体长期的遗传变异。

取样地点及其温度变化统计

取样地点及其温度变化统计

QTL定位结果

QTL定位结果

研究结果:
● 1. 从较温暖海域的夏洛特公主湾(Princess Charlott e Bay,PCB)和纬度相差约5°的较寒冷海域的奥费斯岛(Orpheus Island,OI)共选取了四个colonies。A、B两个 colonies取自OI, C、D取自PCB。两两互交,共构建了10个杂交系。通过耐热性能实验发现:来自较温暖海域的珊瑚繁殖的后代具有更高的耐热性。相较于精细胞,卵细胞能更 有效地将亲本的耐热性传给下一代,表明母性遗传在其中发挥了作用。


● 2. 30份珊瑚幼虫子代样品(3个重复/杂交系;50-70幼虫/重复)和亲本珊瑚24个片段样品(6个样品/colony,包括3个对照3个实验)用于 RNA-Seq。采用SE50测序,子代每个样品的测序数据量为1.4-7.1 M reads, 0.24-1.17 M UT Cs(uniquetranscript counts);亲本每个样品测序数据量为1.9-11.6 M r eads, 0.28-1.52 M UT Cs。RNA-Seq数据分析表明:珊瑚虫的耐热性可能与氧化还原酶、细胞外基质、跨膜转运蛋白和线粒体膜成分等相关。


● 3. 12份亲本样品(3个重复/colony)及326个F1代个体用于2b-RAD建库测序。亲本平均reads数量为3.8 M,子代平均reads数量为0.4 M。SNP分型后使用JoinMap 4.1构建珊瑚的遗传连锁图谱,包括14个连锁群,标记1448个,总长1358 cM。


● 4. QTL定位到2个受耐热性强选择的基因组区域,并结合RNA-Seq数据确定了一个与耐热性能关联性较强的候选基因,证实珊瑚的耐热性是可遗传的。


案例二:群体遗传研究——简化基因组测序2b-RAD进行刺水蚤群体遗传结构及迁移模式分析

研究背景:

在没有物理障碍的情况下,从中小跨度空间上研究浮游生物的群体遗传结构仍然具有挑战性。浮游生物群体大和高频基因流的特点使得区分浮游生物地理分化非常困难,尤其是在分子标记少的情况下。

研究内容:

本研究以大西洋北部的桡足类浮游生物——刺水蚤(Centropages typicus)为研究对象,采用简化基因组测序2b-RAD技术研究刺水蚤在大西洋北部的群体遗传结构,以及刺水蚤沿着西北大西洋大陆架,即从大西洋中部海湾到缅因湾的群体连通性。结果表明,简化基因组测序2b-RAD技术能够辨别浮游生物群体间细微的遗传结构差异,并分析了该海域刺水蚤的迁移模式。

取样地点

取样地点

基因流模型

基因流模型

群体遗传结构分析

群体遗传结构分析


研究结果:

● 1. 从大西洋北部收集刺水蚤样品,取样地点包括位于西北大西洋的MAB(Mid-Atlantic Bight)、SNE(Southern New England Shelf)、GB(Georges Bank)、GoM(Gulf of Maine)和东北大西洋的NS(North Sea)、BB(Bay of Biscay)。共取获61个刺水蚤样品,采用IIB型内切酶BsaXI、选择性接头5’-NNG-3’构建2b-RAD文库,测序平台选用Ion ProtonTM(Life Technologies)。61个个体共获得88.4 M reads,每个个体平均reads数是787,614。以每个等位基因覆盖度>5X,且至少在80%的个体中存在为标准,共筛选到675个标记位 点用于后续分析。


● 2. 两两群体比对结果表明,西北大西洋和东北大西洋不同群体之间具有显著性差异,而西北大西洋四个地区的群体之间没有明显的遗传分化,同样的情况发生在东北大西洋。


● 3. 在群体遗传分析之前,使用BAYESCAN和ARLEQUIN两种不同方法分析受选择的标记。去掉正向选择的位点,保留认为是中性的、平衡选择的位点,然 后用软件STRUCTURE分析刺水蚤的群体结构。分析结果表明,西北大西洋和东北大西洋可明显划分为3个clusters(K=3)。它们之间不是完全 分离的,一些个体拥有混合起源。


● 4. 通过软件MIGRATE-N估算群体间基因流流向,基因流流向评估共有6种模型,即:① Panmictic;②Full;③ Nor th to South;④ South to Nor th;⑤ Adjacent;⑥ Gulf S tream。在6种模型中,Full模型的支持率最高。MAB和SNE的突变扩大群体大小(Mutation-escalated population sizes )稍大于GB和GoM。软件MIGRATE-N分析得到的迁移速率结果表明,从MAB到SNE,也就是向北的洋流强于向南的洋流。



案例三:生物分型——2b- RAD用于李斯特菌的分型

研究背景:

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种食源性致病菌,这类菌最常用的分子分型方法之一是多位点序列分型(MultiLocus Sequence Typing,MLST)。MLST 分型方法选用多个管家基因进行序列分析, 由于管家基因具有序列高度保守的特点, 因此该方法在同一血清型内分型的分辨力较差。

研究内容:

为了建立一种在食品环境中,简单、快速和低成本的细菌分型方法,意大利研究人员成功将简化基因组技术,2b-RAD应用到单核细胞增生李斯特菌的分型,并将该技术与传统的MLST做了比较,结果表明:2b-RAD技术的菌株分型精确度明显优于传统的MLST技术。

两种分型方法结果对比1
两种分型方法结果对比2
两种分型方法结果对比
研究结果:

● 1. 从数据库下载30个单核细胞增生李斯特菌基因组,使用电脑模拟分别进行了MLST分型和2b-RAD分型,结果显示后者较前者分类更精细。


● 2. 从食物中分离到58株李斯特菌,同时进行MLST分型及2b-RAD建库测序研究。结果表明2b-RAD可以预测MLST分型结果;在群落结构方面,2b-RAD能比MLST提供更多信息。一些被MLST分型技术认定为相同的菌株,2b-RAD技术可基于李斯特菌非核心基因组部分进行区分。以上结果均表明:相较于MLST技术,2b-RAD技术更适于进行微生物分型研究。


参考文献


1. Dixon GB, Davies SW, Aglyamova GA , et al. CORAL REEFS. Genomic det erminants of coral heat t olerance across latitudes. Science. 348, 1460-1462(2015). (IF:33.611)

2. Blanco-Bercial L, Bucklin A. New view of population genetics of zooplankton: RAD-seq analysis reveals populationstructure of the Nor th Atlantic planktonic copepod Centropages typicus. Mol Ecol . 25, 1566-1580 (2016).(IF: 6.494)

3. Pauletto M, Carraro L, Babbucci M, et al. Extending RAD tag analysis to microbial ecology: a comparison between MultiLocus Sequence Typing and 2b-RAD t o investigate Listeria monocytogenes genetic struct ure. Mol Ecol Resour .16, 823-835 (2016). (IF: 3.712)