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全基因组Bisulfite甲基化测序(WGBS)

基因组甲基化测序(WGBS)介绍

WGBS(Whole-genome bisulfite sequencing)被视为甲基化测序的“金标准”。其原理是用Bisulfite处理,将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U,进行PCR扩增后变成T,与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来,再结合高通量测序技术,与参考序列比对,即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化,特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。


欧易特色

● 优秀的建库质量:十二年文库技术积淀,具有丰富的样品处理经验和建库经验 

● 完善的质控过程:可以提供整套质控分析,确保数据准确性 

● 丰富的基础分析内容:从各个层面综合解析WGBS数据 

● 更个性化的生物信息分析服务:专业的生物信息分析团队,熟悉各种分析算法和软件;与客户充分互动,提供更多个性化分析 思路和分析方案 

● 易读性强的数据报告:提供全面的数据及图形内容,同时撰写详细的软件使用手册,帮助客户更好的进行数据查看


全基因组甲基化测序(WGBS)项目流程

全基因组甲基化测序流程


推荐测序模式

● Hiseq4000, PE50 

● 30 X基因组大小


数据分析内容


标准数据分析

● 数据质控    ● 产出统计

● 比对参考基因组  ● Reads在基因功能元件上的分布


高级数据分析

● 测序深度统计   ● 基因组覆盖度统计

● C、CG、CHG和CHH平均甲基化水平计算

● 全基因组甲基化水平分布趋势分析

· 各条染色体甲基化水平统计 · 不同基因区域甲基化水平统计

· 不同基因元件甲基化水平统计 · 甲基化Motif序列特征分析

● 全基因组DNA甲基化图谱

● 差异性甲基化区域(DMR)分析


基因组甲基化测序(WGBS)样品要求


● DNA:≥2μg(qubit)

● OD260/280为1.8-2.0


常见问题


● 1. 为什么WGBS所得的raw data产量和Q30比例较全基因组重测序的低?
因为在WGBS建库过程中,非甲基化的C会转化为U(测序过程中呈现为T),因此WGBS文库处于碱基极度不平衡的状态(read1中C含量极低、read2中G含量极低)。而Illumina测序仪在cluster定位过程中会过滤较高比例的cluster,使得raw data产量降低;另外由于GC含量较极端,测序过程中质量值也较容易下降。


● 2. 哪些因素会影响结果?
样品DNA质量、Bisulfite处理过程、测序深度、测序质量等都会影响到最终的结果。


● 3. 怎样保证Bisulfite对DNA处理的完全性?
目前我们建立了标准实验流程,确保Bisulfite对DNA的处理达到生物信息分析要求。我们的标准实验流程是在以标准品DNA和H19等基因位点的多个质量控制步骤下进行严格控制的。


案例展示


案例:全基因组甲基化测序揭示DNA甲基化在植物多倍化前后的作用

研究背景:

被子植物都是异源多倍体,进化过程中至少经历两轮多倍化过程,多倍化会增加基因组的大小和基因的重复。一般在多倍化过程之后会再经历一轮二倍化恢复二倍体状态,在二倍化的过程中,大部分重复基因会发生假基因化、亚功能化或新功能化。转座子在基因组上的移动会造成染色体的异常,转座子插入到基因内部或基因附近也会导致基因失活或基因功能的改变,而DNA甲基化会抑制转座子在基因组中的转座。另外,DNA甲基化也可以参与重复基因表达的调控。在多倍化与物种的特化过程中是否有甲基化发挥作用鲜见报道。大豆是研究多倍化与二倍化的理想材料:大豆与菜豆5600万年前共同经历了一次异源多倍化的过程,1000万年前又各自经历一次多倍化的过程,与菜豆相比,大豆在多倍化后并未立刻二倍化,因此以大豆和菜豆为对象,可以研究DNA甲基化在多倍化前后的作用。

研究内容:

本研究采用WGBS技术,对大豆和菜豆进行全基因组的DNA甲基化检测,比较两者全基因组甲基化水平的差异,结果显示大豆的甲基化位点数目更多,而菜豆的甲基化水平比大豆要高。与转录组数据的联合分析显示,基因表达量与基因区CG甲基化存在负相关关系。对于基因区非CG甲基化的基因,则存在着较多的转座子。因而推测是由转座子和DNA甲基化共同调控多倍化后重复基因的表达。

大豆与菜豆全基因组甲基化比较
重复基因与单拷贝基因甲基化水平的比较
大豆与菜豆全基因组甲基化比较
重复基因与单拷贝基因甲基化水平的比较

研究结果:

● 1. 材料选择:大豆和菜豆,对7天幼苗的根毛和根分别取材,每个组织两个生物学重复,共8个样品


● 2. 建库测序:分别进行WGBS文库构建,样品测序数据量介于140-350M reads(PE101)


● 3. 数据分析:计算不同样品的CG、CHG、CHH位点甲基化水平,并进行样品间的比较。结果表明:与叶片相比,大豆根组织中甲基化位点更多,并且明显富集于转座子丰富、基因贫瘠的着丝粒区域。另外,相比于大豆,菜豆中CHG和CHH位点甲基化水平普遍升高。与转录组测序数据的联合分析显示,基因区CG甲基化与基因表达量存在正相关,而CHG和CH甲基化则为负相关。在大豆中,重复基因比单拷贝基因表达水平更高;而菜豆中趋势相反。对基因或基因附近转座子测序深度统计显示,对于非CG甲基化基因,存在更多转座子


参考文献


Kim KD, El Baidouri M, Aber nathy B, et al. A Comparative Epigenomic A nalysis of Polyploidy-Derived Genes in Soybean and Common Bean. Plant Physiol. 168, 1433-1447 (2015). (IF: 6.841)

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