真核转录组测序-欧易生物

欧易生物

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真核转录组测序

真核转录组测序介绍


转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带。真核生物转录组测序基于高通量测序可全面快速地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的所有转录本的集合,用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控、逆境胁迫和抗病反应机制的最佳研究手段。


欧易特色

● 极强地处理复杂样本的能力
● 丰富的建库经验,加入文库均一化技术
● 协助客户快速、高效、准确性地进行生物信息分析可结合客户的需求
● 灵活进行定制化信息分析

样品要求

● RNA≥4 ug ,浓度≥80ng/μl

● OD260/280为1.8-2.2 

● 适用范围:有无参考基因组皆可


A.真核生物转录组测序(有参考基因组物种)

真核生物转录组测序项目流程

真核生物转录组测序(有参考基因组物种)


推荐测序模式

● HiSeq4000, PE150 

● 5Gb/每个样本


数据分析内容

标准数据分析

● 测序数据质量评估   ● Reads污染检测  ● 参考序列比对

● 差异基因统计分析  ·聚类分析 ·GO富集分析 ·KEGG富集分析


高级数据分析

● 基因结构优化   ● 新转录本预测  ● 可变剪切分析   ● SNP和Indel分析

● 功能层次网络构建   ● 信号通路网络构建  ● 时间序列分析

● 加权基因共表达网络构建(WGCNA)  ● 基因表达趋势分析(STC)


B.真核生物转录组测序(无参考基因组物种)

真核生物转录组测序项目流程

真核生物转录组测序(无参考基因组物种)


推荐测序模式

● HiSeq4000, PE150 

● 10Gb/每个样本


数据分析内容

标准数据分析

● 测序数据质量评估   ● Reads污染检测  ● De novo组装 ● Unigene注释

● 差异基因统计分析  ·聚类分析 ·GO富集分析 ·KEGG富集分析


高级数据分析

● 信号通路网络构建   ● 功能层次网络构建  ● 时间序列分析

● 加权基因共表达网络构建(WGCNA) ● 基因表达趋势分析(STC) 


常见问题


● 1. 转录组测序是否可以同时检测mRNA、miRNA及其他非编码RNA?
理论上技术是可行的,但是通常会根据测序对象长度的不同,在测序建库的时候会选择不同的片段大小,测序读长也会有不同。一般来讲,如果要进行 microRNA测序的话,通常将microRNA分离出来,单独进行测序。mRNA测序,通常建库时选择200-300 bp大小片段,采用125PE/150PE测序。而长链非编码RNA(lncRNA)存在正向转录和反向转录,所以常采去除rRNA后进行链特异性建库测序原则。


● 2. 转录组测序需要多少测序量?
由于转录组测序需要进行表达量的分析,因此不推荐使用覆盖度,在确定测序量时,我们以产生的reads数作为依据。转录
组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响,不同物种间变化很大。因此在测序之前,需要对转录组的大小进行评估。针对有参考基因组的物种,可通过分析基因组信息,统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小,同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章;针对无参考基因组的物种,只能参考相近物种的转录组大小。


● 3. Q20、Q30所代表的碱基质量含义?
为了保证数据质量,要在信息分析前对原始数据进行质量评估。每个碱基测序错误率是通过测序碱基质量值(Phred score,Qphred)通过公式转化得到,而测序质量值是在碱基识别过程通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的,对应关系如下表所显示: 

Pherd分值 不正确的碱基识别 碱基正确识别率 Q-score
10 1/10 90% Q10
20 1/100 99% Q20
30 1/1000 99.9% Q30
40 1/10000 99.99% Q40

案例展示

案例一:半滑舌鳎de novo转录组测序研究

本研究通过对半滑舌鳎采用de novo transcriptome sequencing来鉴定参与其生长发育、繁殖、应激反应、免疫反应等的候选基因,为后续的功能研究提供基础。通过生物信息学分析注释到26,589sequences,其中3,451 transcripts富集到Gene Ontology terms2,362 transcripts富集到186 KEGG pathways。此外,通过repetitive elements分析鉴定了1,898转座元件、7,800 SSR21,234 SNP


真核转录组测序案例:半滑舌鳎de novo转录组测序研究-欧易生物


案例二:拟南芥HY1在脱水逆境下诱导ABA反应调节气孔运动的机制

研究背景:

干旱胁迫严重影响植物的生长、发育和繁殖等生命活动,陆生植物通过一系列复杂的信号网络来调控气孔的开闭以适应干旱胁迫。除了ABA、ROS、NO等,血红素氧化酶(HO)也参与适应性反应的调控,然而HO1(HY1)是否参与拟南芥的干旱胁迫调控目前并不清楚。

真核转录组测序案例:拟南芥转录组测序研究-欧易生物

研究内容:

欧易生物携手南京农业大学研究了拟南芥HY1在干旱胁迫中的调控机制。HY1突变可提高拟南芥的耐旱性,HY1过表达可减弱拟南芥的耐旱性。随后,对野生型、HY1突变株、HY1过表达株分别进行干旱胁迫处理并进行转录组测序生物信息分析表明:HY1参与胁迫/ABA响应的基因表达。此外,进一步的研究表明HY1通过调控ABI4参与干旱诱导的ABA信号通路,而这个信号通路依赖于RbohD产生的 ROS来调控气孔关闭。

研究结果:

● 1. HY1在耐盐通路中为正向调控因子,由于耐盐和耐旱通过ABA信号通路发挥功能,推测HY1在耐旱通路中也是正向调控因子。
通过干旱耐受表型观察HY1敲除突变株能加强拟南芥耐旱性,但HY1过表达则会减少拟南芥耐旱性,由此说明HY1在干旱胁迫中
为负向调控因子。
● 2. HY1负向调控干旱胁迫。通过对野生型和突变型拟南芥材料进行高通量转录组测序,分析结果表明,HY1对拟南芥干旱胁
迫中基因表达有明显影响,且对大部分胁迫/ABA诱发的基因表达确实是需要的。
● 3.干旱胁迫条件下检测HY1功能缺失突变株和获得株的ABA含量,结果表明功能缺失突变株ABA含量高于过表达株系,而且
响应ABA的标记性基因表达水平在hy1突变株里也是降低。同时检测了ABA响应的一些表型,发现hy1突变株显示ABA超敏性状。
以上结果表明HY1负向调控ABA对萌发,萌发后阶段及气孔运动的作用。
● 4. ABI4是ABA信号通路的激活因子或抑制因子。通过ABA生物合成抑制子处理进而检测叶绿体到细胞核逆行通路的标记基因
表达情况,结果显示这些标记基因表达水平受到抑制,由此说明ABI4和HY1参与到该逆行通路。进一步通过ABA处理野生株和
单双杂突变株的种子,观察种子萌发和幼苗发育表型,以及气孔的开闭情况,结果表明在ABA信号通路中ABI4在HY1的下游发
挥调控作用。
● 5. 通过检测野生株和单双杂交株气孔开度,活性氧累积及ABA诱导的基因表达情况,表明RbohD产生的ROS在HY1/ABI4
下游,通过激活GOPK来发挥调控功能。

案例三:山胡椒转录组测序研究

研究背景:

由于山胡椒富含萜类化合物和精油而被认为是一种新工业材料及药用材料,然而山胡椒类萜合成途径(TBP)和精油合成途径(OBP)关于碳源的调控机制还知之甚少。


研究内容:

欧易生物携手北京林业大学采用转录组测序分析开花后5、125和150 天 ( DAF)山胡椒的基因表达情况。81 million reads组装为69、160个unigenes,进一步的生物信息学分析表明:174、71、81和 155个unigenes分别富集到糖酵解、磷酸戊糖途径 (PPP)、TBP 和 OBP。筛选的差异表达基因与qRT-PCR整合分析鉴定了参与调控类萜和精油累积的碳分配比率的关键酶及转录因子,同时为后续的分子育种奠定基础。

上调和下调unigenes的数量及分布情况

上调和下调unigenes的数量及分布情况

研究结果:

● 1. 对不同发育阶段的山胡椒萜类化合物和精油的代谢组检测,发现三个代表性时期(50、125和150天)。这些时期可作为转录组测序所需的检验时间点。
● 2. 通过山胡椒三个发育阶段的转录组测序,发现大部分specific unigene在50天表达,这也说明更多发育和分化的激活过程在早期发生。根据基因表达模式,差异表达基因被分成8类,包括3个上调基因簇,3个下调基因簇和2个混合基因簇。PPP、TBP和OBP相关的基因分别在不同的基因簇表达。
● 3. 通过差异表达基因分析发现可用碳源分配在不同的发育时期被调控,导致碳源在不同时间被分配用于合成TBP和OBP的重要前体。
● 4. 山胡椒不同发育阶段中精油生物合成的基因家族表达水平较高,表明在发育晚期碳源从蔗糖分配到OBP。
● 5. 31个转录因子被分成9个家族,其中10、13和8个高表达的转录因子被分到1、2、3基因簇。这些不同表达模式的转录因子揭示了类萜和精油累积过程中碳源分配复杂的动态调控机制。


案例四:牛耳草转录组测序研究

更苏植物牛耳草在缺水时以一种类似休眠的方式度过严酷的干旱期,在水分条件适宜时又迅速的恢复到正常生长状态。本研究通过对不同处理条件下牛耳草,如air-dried (rapid desiccation)soil-dried (gradual desiccation)rehydrated (acclimated)air-dried after acclimation,进行转录组测序来探讨更苏植物牛耳草的脱水耐受性机理。在air-dried, acclimated plants and soil-dried nonacclimatedplants中,与自噬、α-tocopherol积累相关的转录本被激活。此外,与biosynthesis of ascorbic acid, cell wall catabolism, chaperone-assisted protein folding, respiration and macromolecule catabolism相关的转录本在soil-drying and rehydration过程中被激活。研究表明,在rapid air-drying过程中,通过活化这些生物学过程来维持细胞的最佳生理状态以增强抗性。

真核转录组测序案例:牛耳草转录组测序研究-欧易生物

参考文献

1.Wang W, Yi Q, Ma L, et al. Sequencing and characterization of the transcriptome of half-smooth tongue sole (Cynoglossussemilaevis) [J]. BMC genomics, 2014, 15(1): 470. (IF = 3.986)(欧易客户文章) 

2.Xie Y, Mao Y, Duan X, et al. Arabidopsis HY1-modulated Stomatal Movement: An Integrative Hub for its Functionally Associated with ABI4 in the Dehydration-induced ABA Responsiveness [J]. Plant physiology, 2015: pp. 01550.2015.(IF = 6.841)(欧易客户文章)

3. Niu J, Chen Y, An J, et al. Integrated transcriptome sequencing and dynamic analysis reveal carbon source partitioning
between terpenoid and oil accumulation in dev eloping Lindera glauca fruit s. Sci Rep. 5, 15017 (2015). (IF: 5.578)

4.Zhu Y, Wang B, Phillips J, et al. Global transcriptome analysis reveals acclimation-primed processes involved in the acquisition of desiccation tolerance in Boeahygrometrica [J]. Plant and Cell Physiology, 2015, 56(7): 1429-1441.(IF = 4.931)(欧易署名文章)