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原核生物转录组测序
原核生物转录组测序是基于 HiSeq 平台,构建链特异性文库研究原核生物在某个时期或者在某种环境条件下转录出来的所有 mRNA。通过转录组测序研究可以揭示微生物不同表现型形成的分子调控机制。
欧易特色
具备处理复杂样本的能力
丰富的原核生物转录组测序建库经验,有效去除 rRNA
协助客户快速、准确地进行生物信息分析
可结合客户的需求,灵活进行定制化信息分析
A. 原核生物转录组测序(有参考基因组物种)
推荐测序模式
●  Hiseq X Ten, PE150   ●  1-2 Gb/每个样本
案例展示
案例一  金黄色葡萄球菌转录组测序研究
研究背景
金黄色葡萄球菌可通过参与菌膜形成而引起严重感染,然而具体的作用机制并不清楚。
研究内容
本研究中鉴定了AraC-type转录调控家族中的一个调节蛋白Rsp。当抑制主要的菌膜相关基因的表达及菌膜形成时,Rsp可促进毒素的产生。欧易生物携手上海交大仁济医院通过转录组测序和生物信息学分析研究了Rsp的调控机制。研究表明:Rsp通过上调Agr及下调polysaccharide intercellularadhesin (PIA)来调节毒力影响。深入研究表明,Rsp通过结合 agrP2 和icaADBC启动子,来促进Agr调控的PSMs 和α-toxin的表达,同时抑制PIA的产生。该研究表明Rsp调控子可作为治疗金黄色葡萄球菌急性感染的一个潜在靶标。

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研究结果
1. 通过对野生菌株191和突变菌株rsp进行转录组测序,通过p value < 0.05、FDR < 0.001和FC> 2为标准条件筛选差异表达基因;GO分析富集了20条rsp调控通路;蛋白质间的相互作用通过STRING数据库获得;同rsp调控通路有关的114个下调和35个上调基因被关注,相关的调控网络模型通过cytoscape软件构建。
2. 通过qRT-PCR验证差异表达基因,结果表明Rsp抑制了激活细胞进程的基因表达,诸如细胞壁降解和几条代谢途径;相反的是Rsp激活了同急性毒性有关的基因的表达,诸如参与到细胞溶解,蛋白降解和调控毒性基因表达的双组分调节系统。
3. 由软件RSAT预测agrP2和icaADBC启动子的结合motif,并通过凝胶迁移实验检测Rsp与这些motif的结合情况。实验结果表明Rsp重组体可以在低浓度(≥ 30 g/ml)就结合DNA片段,而且这种结合是特异的。菌膜因子PIA的表达通过Rsp调控,但不受Agr的调控。
4. 为了确定Rsp对毒性因子产生的影响,分别通过HPLC/MS检测PSMs,Western blot s检测α-toxin和protein A,以及immune dot blots检测PIA的产生。实验结果表明Rsp调控基因表达水平的变化,进而影响毒性决定因子的含量。α-t oxin和PSMs受Agr调控的结果,同agr/rsp双突变体的表型是一致的,不能增加溶血细胞。
5. 通过菌血症和皮肤感染的鼠模型来评估Rsp在毒性的影响。结果表明Rsp明显地促进金黄色葡萄球菌的急性模式。
参考文献
Li T, He L, Song Y, et al. AraC-type regulator Rsp adapts Staphylococcus aureus gene expression to acute infection. Infect Immun 2015; 84: 723-734.(IF: 3.731)
B. 原核生物转录组测序(无参考基因组物种)
推荐测序模式
●  Hiseq X Ten, PE150   ●  1-2 Gb/每个样本
案例展示
案例一:黑穗病原菌性别交配和纤维生长的关键环境信号研究
研究背景
黑穗病原菌是导致甘蔗黑穗病的主要病源。该菌拥有两种类型的交配菌株MAT-1 和MAT-2。由于没有基因组序列或者有效的基因操作方法,黑穗病原菌交配的生理学机制几乎是未知的。
研究内容
欧易生物携手华南农业大学研究了黑穗病原菌交配和纤维生长的分子机制。研究通过对突变体SsΔMAT-1b、野生型MAT-1、SsΔMAT-1b X MAT-2和野生型 MAT-1 X MAT-2杂合体进行转录组测序,通过比较差异表达基因发现15个上调基因和37个下调基因,这些基因可能受b位点调控,而且GO和KEGG富集分析表明碳代谢途径和Hog1 MAPK调控的胁迫反应在非交配样品中是改变的。实验表明bE/bW杂合二聚体转录因子调节葡萄糖代谢和Hog1介导的氧化反应,进而调控黑穗病原菌的性别交配和纤维生长。

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研究结果
1. 通过对黑穗菌交配和非交配材料进行转录组测序,获得2G的clean sequencing data,所有转录本总长为17.8344 Mb,测序深度为100 X。同以前报导的黑穗菌的基因组序列比较,这次的序列总长有些短,可能是由于仅仅poly-A尾巴的序列被锚定和测序。总共获得7341个unigenes,大部分长度为200–2000 bp, GC含量为50–60%。
2. 通过比较两组非交配和交配菌株的差异表达基因,结果表明黑穗菌在交配和纤维生长过程中,b位点调控了小分子运输、囊泡运输、生物合成、MAPK信号通路调控的逆境胁迫和转录网络的级联效应。
3. GO富集分析进一步验证b位点调控代谢、生物合成、跨膜运输和氧化还原平衡过程,这些过程同交配或者纤维生长紧密相连。KEGG富集分析进一步确认单倍体和交配体均发生信号转导途径中的代谢途径,尤其是淀粉和蔗糖代谢通路。
4. 通过检测野生型MAT-1、MAT-2、SsΔMAT-1b 突变体、MAT-1 X MAT-2杂合体的生长,以及抗氧化剂谷胱甘肽在单倍体和杂合体菌落及纤维生长的影响,实验结果表明葡萄糖负向调控黑穗菌交配和纤维生长,且b位点编码的异源转录因子在转录水平调控了淀粉/蔗糖代谢。
参考文献
Yan M, Dai W, Cai E, et al. Transcriptome analysis of Sporisorium scitamineum reveals ciricalenvirommental signals for fungal sexual mating and filamentous growth. BMC Genomics 2016; 17:354. (IF: 3.986)
常见问题及解答
1. 原核生物与真核生物在进行转录组测序文库构建时有什么区别?
在原核生物中,mRNA 只占全部 RNA 的 1-5%,其余绝大部分是核糖体 RNA(rRNA),因此若要测序 mRNA,首先需要先将 mRNA 纯化出来。然而,原核生物并不像真核生物 mRNA 具有 polyA 的结构,因此,无法直接利用 oligo(dT) 将
mRNA 纯化出来。如果拿 total RNA 进行测序,那么测序的效率会比较差,因为大部分的序列都来自 rRNA。目前,提高原核生物中 mRNA 的量,较为主要的方式是去除 total RNA 中 rRNA。
2. 关于转录组 De novo 分析,采用什么软件进行拼接,使用的参数是什么?
De novo 拼接是指在不依赖参考基因组的情况下,将有 overlap 的 reads 连接成一个更长的序列,经过不断的延伸,拼接成  transcript。我们使用 Trinity (version:trinityrnaseq_r20131110_ 软件 paired-end 的拼接方法,对样本的有效 reads 合并进行 de novo 拼接,取每个 Loci (comp*_c*_) 下较长的转录本作为 Unigene,以此作为后续分析的参考序列。参数为
:Trinity.pl --seqTypefq --min_contig_length 200 --JM 400G --left $R1 --right $R2 --SS_lib_type RF --output
trinity_out_dir --CPU 80。
3. Raw data 如何读取?为什么不提供原始图像数据和中间过程文件?
测序数据文件以 txt 文本格式为主。对于 Windows 用户,推荐使用 Editplus 或 UltraEdit 作为浏览程序,否则会因文件过大造成死机。Unix 或 Linux 系统比较适于浏览较大的文本文件。由于 Illumina 更新了 pipeline,测序过程中生成的图像文件将实时转化为中间过程文件,这一步完成后图像文件将被自动删除,获取中间过程文件(此文件为二进制文件,只有在 Illumina 机器上才能读取,通常不保留),在 Illumina 分析软件下将其转化为序列文件,即所说的 raw data 。目前各公共数据库接受 fastq 文件,所以我们提供的 raw data 都是 fastq 文件。


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