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原核转录组测序

原核转录组测序介绍


原核生物转录组测序是基于HiSeq平台,构建链特异性文库研究原核生物在某个时期或者在某种环境条件下转录出来的所有mRNA。通过转录组测序研究可以揭示微生物不同表现型形成的分子调控机制。


欧易特色


● 极强地处理复杂样本的能力
● 丰富的原核生物转录组测序建库经验,有效去除rRNA
● 协助客户快速、高效、准确性地进行生物信息分析

● 可结合客户的需求,灵活进行定制化信息分析


原核转录组测序样品要求


● RNA≥2 μg 

● OD260/280为1.8-2.2 

● 适用范围:有无参考基因组皆可


A.原核生物转录组测序(有参考基因组物种)


原核转录组测序项目流程

原核生物转录组测序(有参考基因组物种)

推荐测序模式

● Hiseq4000,PE150 

● 1-2 Gb/每个样本


数据分析内容

标准数据分析

测序数据质量评估   ● Reads污染检测  ● 参考序列比对

● 差异基因统计分析  ·聚类分析 ·GO富集分析 ·KEGG富集分析


高级数据分析

● 基因结构优化   ● 新转录本预测

● 可变剪切分析   ● SNP和Indel分析

● 功能层次网络构建   ● 信号通路网络构建

● 时间序列分析   ● 基因表达趋势分析(STC)


B.原核生物转录组测序(无参考基因组物种)


原核转录组测序项目流程

原核生物转录组测序(无参考基因组物种)


推荐测序模式

● Hiseq4000,PE150 

● 1-2 Gb/每个样本


数据分析内容

标准数据分析

● 测序数据质量评估   ● Reads污染检测

● De novo组装 ● Unigene注释

● 差异基因统计分析  ·聚类分析 ·GO富集分析 ·KEGG富集分析


高级数据分析

● 信号通路网络构建 ● 功能层次网络构建

● 时间序列分析 ● 基因表达趋势分析(STC)


常见问题


● 1. 原核生物与真核生物在进行转录组测序文库构建时有什么区别?
在原核生物中,mRNA只占全部RNA的1-5%,其余绝大部分是核糖体RNA(rRNA),因此若要测序mRNA,首先必须先将
mRNA纯化出来,然而,原核生物并不像真核生物mRNA具有polyA的结构,因此,无法直接利用oligoT将mRNA纯化出来,如果拿total RNA进行测序,那么测序的效率一定会非常差,因为大部分的序列都来自rRNA。目前,提高原核生物中mRNA的量,最主要的方式是去除total RNA中rRNA。


● 2. 关于转录组De novo分析:你们采用什么软件进行拼接,使用的参数是什么?
De novo拼接是指在不依赖参考基因组的情况下,将有overlap的reads连接成一个更长的序列,经过不断的延伸,拼接成
transcript。我们使用Trinity(version:trinityrnaseq_r20131110)软件paired-end的拼接方法,对样本的有效reads合并进行de novo拼接,取每个Loci(comp*_c*_)下最长的转录本作为Unigene,以此作为后续分析的参考序列。使用参数为:Trinity.pl--seqTypefq --min_contig_length 200 --JM 400G --lef t $R1 --right $R2 --SS_lib_type RF --outputtrinity_out_dir --CPU 80。


● 3. Raw data 如何读取?为什么不提供原始图像数据和中间过程文件?
测序数据文件以txt 文本格式为主。对于 Windows 用户,推荐使用Editplus或UltraEdit作为浏览程序,否则会因文件过大造成死机。Unix 或Linux 系统比较适于浏览较大的文本文件。由于Illumina更新了pipeline,测序过程中生成的图像文件将实时转化为中间过程文件,这一步完成后图像文件将自动删除,得到中间过程文件(此文件为二进制文件,只有在Illumina机器上才能读取,通常不保留),在Illumina分析软件下将其转化为序列文件,即所说的raw data 。目前各公共数据库接受fastq文件,所以我们提供的raw data 都是fastq文件。


案例展示

案例一:金黄色葡萄球菌转录组测序研究

研究背景:

金黄色葡萄球菌可通过参与菌膜形成而引起严重感染,然而具体的作用机制并不清楚。


研究内容:
本研究中鉴定了AraC-type转录调控家族中的一个调节蛋白Rsp。当抑制主要的菌膜相关基因的表达及菌膜形成时,Rsp可促进毒素的产生。欧易生物携手上海交大仁济医院通过转录组测序和生物信息学分析研究了Rsp的调控机制。研究表明:Rsp通过上调Agr及下调polysaccharide intercellularadhesin (PIA)来调节毒力影响。深入研究表明,Rsp通过结合 agrP2 和icaADBC启动子,来促进Agr调控的PSMs 和α-toxin的表达,同时抑制PIA的产生。该研究表明Rsp调控子可作为治疗金黄色葡萄球菌急性感染的一个潜在靶标。

原核转录组测序案例:金黄色葡萄球菌转录组测序研究-欧易生物

图1. 不同条件下的基因表达量以及差异性表达基因在两种条件下的功能分类Rsp对菌膜和毒性相关基因的影响

研究结果:
● 1. 通过对野生菌株191和突变菌株rsp进行转录组测序,通过p value < 0.05、FDR < 0.001和FC> 2为标准条件筛选差异表达基因;GO分析富集了20条rsp调控通路;蛋白质间的相互作用通过STRING数据库获得;同rsp调控通路有关的114个下调和35个上调基因被关注,相关的调控网络模型通过cytoscape软件构建。
● 2. 通过qRT-PCR验证差异表达基因,结果表明Rsp抑制了激活细胞进程的基因表达,诸如细胞壁降解和几条代谢途径;相反的是Rsp激活了同急性毒性有关的基因的表达,诸如参与到细胞溶解,蛋白降解和调控毒性基因表达的双组分调节系统。
● 3. 由软件RSAT预测agrP2和icaADBC启动子的结合motif,并通过凝胶迁移实验检测Rsp与这些motif的结合情况。实验结果表明Rsp重组体可以在低浓度(≥ 30 g/ml)就结合DNA片段,而且这种结合是特异的。菌膜因子PIA的表达通过Rsp调控,但不受Agr的调控。
● 4. 为了确定Rsp对毒性因子产生的影响,分别通过HPLC/MS检测PSMs,Western blot s检测α-toxin和protein A,以及immune dot blots检测PIA的产生。实验结果表明Rsp调控基因表达水平的变化,进而影响毒性决定因子的含量。α-t oxin和PSMs受Agr调控的结果,同agr/rsp双突变体的表型是一致的,不能增加溶血细胞。
● 5. 通过菌血症和皮肤感染的鼠模型来评估Rsp在毒性的影响。结果表明Rsp明显地促进金黄色葡萄球菌的急性模式。


案例二:黑穗病原菌性别交配和纤维生长的关键环境信号研究

研究背景:

黑穗病原菌是导致甘蔗黑穗病的主要病源。该菌拥有两种类型的交配菌株MAT-1 和MAT-2。由于没有基因组序列或者有效的基因操作方法,黑穗病原菌交配的生理学机制几乎是未知的。

研究内容:

欧易生物携手华南农业大学研究了黑穗病原菌交配和纤维生长的分子机制。研究通过对突变体SsΔMAT-1b、野生型MAT-1、SsΔMAT-1b X MAT-2和野生型 MAT-1 X MAT-2杂合体进行转录组测序,通过比较差异表达基因发现15个上调基因和37个下调基因,这些基因可能受b位点调控,而且GO和KEGG富集分析表明碳代谢途径和Hog1 MAPK调控的胁迫反应在非交配样品中是改变的。实验表明bE/bW杂合二聚体转录因子调节葡萄糖代谢和Hog1介导的氧化反应,进而调控黑穗病原菌的性别交配和纤维生长。

Unigenes的长度和GC含量
差异表达基因的GO富集分析
研究结果:
● 1. 通过对黑穗菌交配和非交配材料进行转录组测序,得到2G的clean sequencing dat a,所有转录本总长为17.8344 Mb,测序深度为100 X。同以前报导的黑穗菌的基因组序列比较,这次的序列总长有些短,可能是由于仅仅poly-A尾巴的序列被锚定和测序。总共得到了7341个unigenes,大部分长度为200–2000 bp, GC含量为50–60%。
● 2. 通过比较两组非交配和交配菌株的差异表达基因,结果表明黑穗菌在交配和纤维生长过程中,b位点调控了小分子运输、囊泡运输、生物合成、MAPK信号通路调控的逆境胁迫和转录网络的级联效应。
● 3. GO富集分析进一步验证b位点调控代谢、生物合成、跨膜运输和氧化还原平衡过程,这些过程同交配或者纤维生长紧密相连。KEGG富集分析进一步确认单倍体和交配体均发生信号转导途径中的代谢途径,尤其是淀粉和蔗糖代谢通路。
● 4. 通过检测野生型MAT-1、MAT-2、SsΔMAT-1b 突变体、MAT-1 X MAT-2杂合体的生长,以及抗氧化剂谷胱甘肽在单倍体和杂合体菌落及纤维生长的影响,实验结果表明葡萄糖负向调控黑穗菌交配和纤维生长,且b位点编码的异源转录因子在转录水平调控了淀粉/蔗糖代谢。


案例三:RNA测序检测霍乱弧菌基因表达的变化

本研究使用大规模并行RNA-seq技术对来自两个感染的动物模型的霍乱弧菌进行研究,样本分别来自感染小鼠的 肠匀浆和兔子的盲肠液体。结果表明感染的兔子和实验室培养的小鼠转录本的升高,主要来自于已知霍乱弧菌致 病因子,以及此前不曾与毒性相关的基因和small RNA中。

原核转录组测序案例:RNA测序检测霍乱弧菌基因表达的变化-欧易生物
图2. 霍乱弧菌基因在培养和感染过程的表达

案例四:转录组分析熊果酸和白藜芦醇对抗甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

微生物膜会对大多数可用的抗生素产生抑制作用,新的潜在的拮抗剂用来抑制生物膜的形成变得极为迫切。本 研究探讨了两个天然产物熊果酸和白藜芦醇对临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的生物膜的抑制作 用。通过RNA-seq技术对差异表达的基因进行了分析。结果表明熊果酸抑制生物膜形成可以减少氨基酸代谢和粘 附素表达,白藜芦醇可以干扰群体感应和表面蛋白与荚膜多糖的合成。转录组的分析结果表明,对于MRSA所涉 及的感染中,熊果酸和白藜芦醇作为辅助疗法可能是有用的。

原核转录组测序案例:转录组分析熊果酸和白藜芦醇对抗甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用-欧易生物
图3. 不同条件下的基因表达量以及差异性表达基因在两种条件下的功能分类

参考文献

1.Li T, He L, Song Y, et al. AraC-type regulator Rsp adapts Staphylococcus aureus gene expression to acute infection [J]. Infection and immunity, 2015: IAI. 01088-15.(IF = 3.731)(OE客户文章) 
2.Yan M, Dai W, Cai E, et al. Transcriptome analysis of Sporisorium scitamineum reveals critical environmental signals for fungal sexual mating and filament ous growth. BMC genomics. 17, 354 (2016). (IF: 3.986)

3.Mandlik A, Livny J, Robins W,et al. RNA-Seq-Based Monitoring of Inflection Linked Changes in Vibrio chol-era Gene Expression. Cell host&mirobe,2011;10(2):165-174

4.Qin W, Tan X, Jiao Y, et  al.RNA-Seq-Based transcriptome analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilm inhibition by ursolic acid and resveratrol. Scientific reports,2014;4:5467

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