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环状RNA测序(circRNA测序)

环状RNA(circRNA)测序介绍


环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA(linear RNA,含5’和3’末端)不同,circRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。近几年的研究表明,circRNA在生物的生长发育、对外界环境的抵御等方面具有重要的调控作用。由于circRNA的闭合环状特性,通过去除total RNA中的rRNA和线性RNA分子,可以特异地富集circRNA分子后测序,更有针对性地分析受检样本中特定的circRNA谱、circRNA剪接模式、组间差异和功能等。


欧易特色


● 应用范围广:可以检测几乎任何动植物的环状RNA
● 环状RNA全覆盖:高深度覆盖,可以检测到低丰度的稀有circRNA

● 专业化的生物信息学分析:强大的生物信息学团队,提供新环状RNA鉴定、环状RNA功能预测、环状RNA分子标志物筛选等深入分析易读性强的数据报告


环状RNA(circRNA)项目流程


circrna流程


推荐测序模式


● Hiseq4000,PE150 

● 推荐10 Gb/样本


环状RNA(circRNA)测序样品要求


● ≥20 μg (qubit) , 浓度≥250 ng/μl 

● OD260/280为1.8-2.2

● 适用范围:有参考基因组的真核生物


数据分析内容


标准数据分析

● 原始测序数据质控   ● 测序数据质量评估   ● Reads污染检测   ● circRNA鉴定

● circRNA来源基因注释   ● circRNA基因结构分析   ● circRNA的表达丰度   ● circRNA差异表达分析


高级数据分析

● circRNA-miRNA互作分析、互作网络图绘制

● ceRNA分析   ● WGCNA分析


常见问题


● 1. cricRNA测序和普通的RNA-seq,在抽提total RNA时有区别吗?
circRNA测序对total RNA的要求与普通的RNA-seq相同,所以抽提方法也相同。但是由于circRNA建库需要去除rRNA和线性RNA,所以需求大量的total RNA,需提供大于等于22 μg的total RNA,其中20 μg用于circRNA建库。


● 2. 全转录组测序和circRNA测序区别在哪里?如何选择?
两种测序方式的相同之处为都可以获得circRNA序列信息。不同之处在于,全转录组测序除了circRNA序列信息外,还可以获得mRNA和lncRNA的序列信息,可以进行circRNA-mRNA、lncRNA-mRNA关联分析和网络构建,lncRNA的调控机制(cis和trans)等分析;但由于建库方式的差异和测序数据量的限制,全转录组测序所获得的circRNA类型通常比circRNA测序要少。而circRNA测序,只能获得circRNA序列信息,但circRNA测序可以获得比全转录组测序更多的circRNA类型,可以对circRNA的剪接模式和circRNA类型进行更细致、深入的分析,便于发现新的circRNA。


● 3. 由于测序获得的都是reads,如何鉴定分析获得的circRNA是circRNA,而不是mRNA或lncRNA呢?
首先,从建库上,cir cRNA测序采取去线性RNA的建库方式,这种建库方式会去掉绝大部分线性的RNA序列。其次,生物信息分析上,会根据cir cRNA的特殊剪切方式,进行circRNA的鉴定。大多数内含子剪切位点具有GT-AG模式,即经典剪切位点,而circRNA的剪切方式为反向剪切成环方式(如下图),mapsplice、findcirc、CICR软件会根据序列和基因组的比对情况,鉴定出反向剪切位点信息,以及鉴定出可能的circRNA序列。

circRNA的剪切方式

circRNA的剪切方式


案例展示

案例一 :水稻和拟南芥的circRNA鉴定

研究背景:

circRNA作为近几年新发现的非编码RNA,在动物中,特别是人的相关研究较多,但在植物中的研究非常有限。植物中的circRNA是否与动物中的circRNA具有相同的特质、发挥相似的调控作用?

研究内容:

本文以水稻和拟南芥为研究对象,对从NCBI上下载获得的水稻和拟南芥RNA-seq数据进行分析,分别获得12307个和6012个circRNAs,其中占比最高的circRNAs类型为exonic circRNAs,并从中挑选部分circRNAs进行验证。对植物circRNA序列特征分析,发现植物的circRNA与动物的circRNA存在着一些明显序列特征性差异。

cricRNA鉴定流程图
水稻和拟南芥circRNA类型和数量统计

cricRNA鉴定流程图
水稻和拟南芥circRNA类型和数量统计

研究结果:

● 1. 从NCBI数据库中下载水稻(水稻根)和拟南芥(拟南芥叶片)的RNA-seq数据(reads长度分别为101bp、100bp),利用Bowtie2比对到参考基因组,舍弃所有mapped的序列;对所有unmapped的reads,两端分别提取20nt后再次进行基因组比对(称之为anchor reads),确定anchor reads在基因组的位置,以此判断原始reads是否存在circRNA splicing。通过这种分析方法,分别从水稻和拟南芥中获得12307个和6012个circRNAs,其中exonic circRNAs占比最高,即来源于外显子的circRNAs。另外有较大比例的circRNAs来源于基因间的反式反向剪切(trans-backsplicing)。


● 2. 针对水稻中表达丰度最高的18个exonic circRNAs,分别设计一对convergent引物、一对divergent引物,分别利用反转录之后的cDNA和基因组DNA进行PCR扩增,然后利用电泳对扩增条带检测,结果为10个circRNAs得到验证。


● 3. 为了了解植物中circRNA与动物中的区别,对植物circRNA序列特性进行分析,发现有700个生成circRNAs的parent基因
在水稻和拟南芥中为直系同源基因,分别占各自parent基因比例为12.2%、14.5%;由于两物种用于检测circRNAs组织部位和处理条件不同,这一占比例已经相当高,并且有300对直系同源基因在相似位置生成了circRNAs。这一结果表明,植物中的circRNA具有较强的保守性。


● 4. 植物中exonic circRNA相邻的intron区域大小明显大于线性RNA的intron区域大小,这一结论与动物中研究结果一致。
但与动物circRNA相邻的intron区域多为重复序列或反向互补序列不同,植物circRNA相邻intron区域中两类序列有限。这一结果暗示动植物中circRNA的生成可能采用不同机制。



案例二:环状RNA表达谱检测及功能研究

动物体内的环状RNA(circRNA)是谜一样具有未知功能的RNA。为系统研究环状RNA,本研究对人、小鼠以及线虫的RNA进行了测序和分析,检测到了上千种表达很好的稳定的环状RNA,它们通常具有组织或发育阶段的特异性表达。从上述结果中发现了一种人类的环状RNA,与小脑变性相关蛋白-1的转录物( CDR1as) 呈反义,可与miRNA效应因子复合物结合,它含有67个miR-7结合位点。进一步的分析指出,CDR1as在神经组织中与miR-7结合。在斑马鱼中表达人的CDR1as会破坏中脑的发育,与miR-7的缺失相似,说明CDR1as是一种miRNA的拮抗剂,其结合miRNA的能力比其他已知的转录物高10倍。

circRNA测序
图1. 差异环状RNA统计



案例三:上皮细胞间质化(EMT)过程中QKI蛋白对circRNA形成的调控作用

环状RNA(circRNA)是动物细胞中广泛存在的一种非编码RNA,因其表达具有细胞特异性,所以预示着环状RNA在形成过程中受到特定的调控。本研究通过对HMLE和mesHMLE两种细胞进行转录组测序,明确了circRNA的数目与表达水平在两种细胞中的显著差异。结合双色荧光筛选系统circScreen与后续实验发现,RNA结合蛋白QKI在EMT过程中显著升高; QKI通过结合pre-mRNA上的特定结合位点,促进环状RNA的形成;随着QKI表达量升高,环状RNA的数目和表达量也随之增加。

circRNA测序
图2. EMT过程中,QKI对环状RNA形成的调控作用

参考文献

1.Ye CY, Chen L, Liu C, et al. Widespread noncoding circular RNAs in plants. New Phytol. 208, 88-95 (2015). (IF: 7.21)

2.Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature,2013;495:333-338.

3. Simon J. Conn, Katherine A. Pillman, Gregory J. Goodall, et al. The RNA binding protein Quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 2015; 160(6): 1125–34.

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