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酵母文库筛选

在酵母双杂交系统中,编码诱饵蛋白和靶蛋白的基因分别克隆进 BD 和 AD 载体,这样使得待研蛋白可融合表达 GAL4 DNA 结合结构域和 GAL4 激活结构域。以上的两种载体共转化酵母细胞。如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用,那么 GAL4 DNA 结合结构域和 GAL4 激活结构域就会相互作用,从而激活 lacZ 报道基因的表达。通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相互作用。

欧易特色

十余年丰富的文库构建、文库筛选经验         

原装试剂盒、培养基,保证实验质量

可提供核体系、膜体系筛库工作      

可提供共转、mating 筛库服务

根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案

常见问题

1. 如何确定是选择构建核体系文库还是膜体系文库?

主要是根据所关注的诱饵蛋白在细胞内的定位情况来确定:
1) 如果诱饵基因是定位在膜上的蛋白则选择膜体系文库;
2) 如果诱饵基因是定位于核则选择核体系文库;
3) 如果诱饵基因有跨膜区也可以考虑把跨膜区切除后用核体系文库筛库,但是这样操作有一定风险;
4) 如果诱饵基因是定位在细胞质,可以选择核体系或者膜体系文库。

2. mating 和共转两种筛库方法到底哪种好?

两种方法各有千秋,没有所谓的好与不好,主要根据老师的实验条件和操作习惯。
只要操作和 BD 构建没有问题都不会影响筛库的效率,老师可以选择任意一种方法进行筛库。

3. 如果诱饵蛋白有毒性怎么办?

1) 可以使用低拷贝的 pGBT9 质粒构建诱饵载体;
2) 在某些情况下,在液体培养基中培养不好的菌株可以在固体培养基上生长得很好。
首先重悬克隆于 1 ml 的 SD/–Trp;
接着将重悬液平铺于 5 个 100 mm 的 SD/–Trp 平板,在 30℃ 下温浴,直至平板上的克隆相互粘在一起;
5 ml 0.5X YPDA 刮下每块板上的克隆,并收集到一管中。这样就可以使用这个该细胞重悬液进行正常的杂交反应。

4. 如果诱饵蛋白有自激活怎么办?

如果诱饵蛋白有自激活现象,建议找出该蛋白的激活区域,然后将激活区域删除后重新构建 BD 质粒。
如果自激活不严重,可以通过增加筛选的严谨度(培养基中添加适当浓度的 3-AT)继续进行筛选。

5. 其他注意事项 

1)感受态细胞建议在冰上融化。 
2)转化高浓度的质粒可相应减少并用于涂板的菌量。 
3)同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。 
4)酵母菌株对高温敏感,适合生长的温度为 27-30℃;高于 31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。 
5)菌落变红不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象:
当细胞在平板培养几天后,平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用。

然而,有些菌株的 ADE2 基因被破坏,Adenine 合成途径受阻;又由于其 ADE4, 5, 6, 7, 8 基因均正常,所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。


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