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lncRNA测序

lncRNA测序介绍


长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。利用新一代高通量测序技术进行lncRNA测序,并结合生物信息学的预测工具进行lncRNA分析,有助于科研工作者更快发现那些具有重要调控功能的lncRNA,分析其与特定生物学过程的关系。该方法可以更加高效地获取lncRNA序列以及位置信息,且突破了常规lncRNA芯片检测技术的使用范围限制,还可对新的lncRNA进行预测及功能分析,极大促进lncRNA的深入研究。

欧易特色

● 技术稳定,建库重复性好:同一样本重复建库相关性Pearson值大于0.993
● 高特异性:使用特定方法降低样本中rRNA的丰度
● 高准确度:构建链特异性转录组文库,快速、高效、准确地获取样本中几乎全部的lncRNA序列及其位置信息
● 分析严格:系统鉴定已知lncRNA,设置严格的筛选条件用于发现新的lncRNA
● 独具特色的lncRNA高级分析:lncRNA cis和trans调控机制以及ceRNA调控机制等
● 经验丰富:已对多种动植物的lncRNA进行测序分析

lncRNA测序项目流程

lncrna流程


推荐测序模式

● Hiseq4000, PE150 

● 一般测序:10 Gb/样本 

● 深度测序:20 Gb/样本


数据分析内容

标准数据分析

● 原始测序数据质控   ● 测序数据质量评估

● Reads污染检测   ● 参考基因组比对

● 转录本重建/组装分析   ● 潜在长链非编码RNA挖掘

● 长链非编码RNA特征分析   ● lncRNA表达量分析

● 差异表达分析


高级数据分析

● lncRNA-mRNA共表达分析  ● ceRNA分析

● lncRNA cis、trans分析  ● WGCNA分析


lncRNA测序样品要求


● Total RNA:≥2 μg ,浓度≥100ng/μl

● OD260/280为1.8-2.2

● 适用范围:有参考基因组物种


案例展示

案例一:海绵lncRNA表达模式研究

研究背景:

lncRNAs在两侧对称动物中是一类重要的调控因子。目前已经对lncRNA在脊椎动物进化过程中的作用有大量研究报道,但是在形态学上简单动物中的作用还没有报道。


研究内容:

本文以堡礁海绵为研究对象,对海绵生命周期的四个时期:precompetent larva、competent larva、juvenile、adult的RNA-seq数据进行分析,鉴定到2935个lncRNAs。海绵lncRNAs与蛋白编码基因相比,外显子数量较少,这些特征与海绵动物相对应的两侧对称动物lncRNAs非常相似。大部分海绵lncRNAs具有时间特异性和动态表达模式。某些lncRNAs参与发育和生理过程,如Wnt信号通路。因海绵lncRNAs与对应的两侧对称动物的lncRNAs具有相似的结构和动态表达模式,研究者提出这些非编码RNAs是后生动物基因组的特征。结果表明,不管动物的形态学复杂性与否,lncRNAs都可以参与动物的发育调控。

堡礁海绵生命周期
海绵lncRNA和编码基因的时序表达模式
堡礁海绵生命周期
海绵lncRNA和编码基因的时序表达模式

研究结果:

● 1. 测序鉴定到2935个高可信度海绵lncRNAs,包含1083个lncRNAs、1469个intronic lncRNAs和383个antisense exonic
lncRNAs。海绵lncRNAs与蛋白编码基因相比,外显子数量较少,这些特征与海绵动物相对应的两侧对称动物lncRNAs非常相似。
● 2. 差异分析发现900个lncRNAs(30.7%)在任意连续两个发育时期间的表达存在显著性变化。competent lar va与precompetent相比,差异表达lncRNAs为169个;juvenile与competent lar va相比,差异表达lncRNAs为538个;adult与juvenile相比,差异表达lncRNAs为396个。以上结果表明海绵lncRNAs在整个发育过程中是动态表达的。
● 3. 分析发现197个lncRNAs(>50 tpm)和相关的3021个编码基因(>1000 tpm)具有高度严格的时序表达模式。
● 4. 筛选到17个lncRNAs与编码基因表达高度相关(相关系数r2>0.95),GO富集分析发现与6个lncRNAs相关的编码基因参与后生动物的发育过程,如细胞粘附、形态发生和信号转导。
● 5. 经序列相似性分析发现,海绵lncRNAs序列保守性较低。


案例二:玉米lncRNA测序

研究背景:

lncRNA在真核生物中在多层面对基因表达起到重要调控作用,但是目前在玉米中lncRNA的数量、特点和表达的遗传模式在很大程度上仍然是未知的。


研究背景:

本研究通过分析玉米EST、全基因组、RNA-seq等数据,从中预测到20163个lncRNAs,推测其中90%以上可能是小RNA的前体,1704个为高度可信的lncRNAs。13个不同的组织和105株玉米重组自交系的RNA-Seq数据结果显示,lncRNAs具有较强的组织特异性。本研究提供了一个独特的玉米基因组注释资源和玉米lncRNAs全基因组特征,并利用eQTL分析得到玉米lncRNA表达模式的遗传规律。

lncRNA测序案例:玉米lncRNA测序-欧易生物
图1. 玉米10条染色体上lncRNAs的分布

lncRNA测序案例:玉米lncRNA测序-欧易生物
图2. 玉米lncRNA表达的eQTL定位结果

lncRNA测序案例:玉米lncRNA测序-欧易生物
图3. lncRNA与mRNA共表达分析

研究结果:

● 1. 高度可信的1704个lncRNAs平均长度463 bp,并且与功能基因相比,lncRNAs所包含的外显子更少,81%只含有一个外
显子。
● 2. 在13个组织和105个RILs材料中RNA-seq结果显示,这些lncRNAs的50%以上具有组织表达特异性。

● 3. 通过eQTL定位分析发现,玉米的lncRNAs更多受到trans调控而非cis调控。


案例三:lncRNA在蜜蜂发育和疾病中的作用

研究背景:
西方蜜蜂(意蜂)是一个对于理解社会行为,疾病传播和发展的重要模型。亚洲蜜蜂(中华蜜蜂)在许多亚洲国家是重要的传粉昆虫。这两种蜜蜂类型已经用于医学研究和神经生物学、发育生物学、行为科学和表观基因组学方面的研究。尽管已有4个蜜蜂lncRNAs应用于临床研究,但还没有在其整个基因组水平上进行lncRNA研究。

研究内容:

研究人员首先利用数据库下载6个组织RNA-seq数据以及新的SBV感染和未感染的蜜蜂幼虫测序数据(49 M-78 M r eads)鉴定两种蜜蜂中的lncRNAs,然后筛选与蜜蜂病毒性疾病相关的lncRNAs,发现这些lncRNAs与激素信号传导和代谢相关,最后利用qRT-PCR对lncRNAs表达情况进行验证,本研究有助于进一步了解lncRNA对基因表达的调控机制。

亚洲蜜蜂lncRNAs特征

亚洲蜜蜂lncRNAs特征

研究结果:

● 1. 在中华蜜蜂中鉴定到2470个lncRNAs,平均长度1011 bp;在意蜂中鉴定到1514个lncRNAs,平均长度79 0 bp。
● 2. 基因表达分析显示在蜜蜂的七种主要组织中lncRNA具有高度的组织特异性,且表达模式与mRNA也是明显不同的。在意蜂和中华蜜蜂中分别有863(57%)和464个(18%)lncRNAs表达具有组织特异性,其中大部分存在于卵巢和脂肪体组织中。
● 3. 在病毒感染蜜蜂中鉴定到11个特异性lncRNAs,其中10个lncRNAs在多种病毒感染中起到重要作用。


案例四:人类全基因组范围内大规模lncRNA的表达鉴定

lncRNA在许多生理过程及疾病发生中都发挥着非常重要的调控作用,为比较全面地了解全基因组范围内lncRNA的表达情况,本项目整合了25个研究中的7256个RNA-Seq的数据,对来源于肿瘤组织、正常组织和细胞系的43T数据进行了整理分析,阐明了与癌症显著相关的lncRNA。整个项目中对lncRNA表达谱的构建可能用于解释生物学过程和癌症的发病机理,对于生物标记的开发也具有很高的应用价值。

lncRNA测序案例:人类全基因组范围内大规模lncRNA的表达鉴定-欧易生物
图4. 27种不同组织中lncRNA统计情况


参考文献

1.Gaiti F, Fernandez-Valverde SL, Nakanishi N, et al. Dynamic and W idespread lncRNA Expression in a Sponge and
the Origin of Animal Complexity. Mol Biol Evol . 32, 2367-2382 (2015). (IF: 13.649)

2.Li L, Eichten S, Shimizu R, et al. Genome-wide discovery and characterization of maize long non-coding RNAs. Genome Biology, 2014; 15(2): R40

3. Jayakodi M, Jung JW, Park D, et al. Genome-wide characterization of long intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)provides new insight into viral diseases in honey bees Apis cerana and Apis mellifera. BMC genomics. 16, 680 (2015).(IF: 3.867)

4.Iyer MK, Niknafs YS, Malik R, et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. Nat Genet. 2015; 47(3):199-208.

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