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膜体系酵母文库

酵母双杂交(Yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段。经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于还可发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
传统的酵母双杂交系统仅限于核蛋白的互作分析,不能进行膜蛋白的研究。DUALmembrane 系统(DUALmembrane system)是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统,它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法,使得分析膜蛋白间的互作成为现实。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选,也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。

DUAL membrane系统

在酵母细胞中,泛素可分为两部分表达,即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub),后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白([NubI:Cub]-reporter)体系。

DUAL membrane系统技术特点

任何一种膜蛋白都可以作为诱饵
在细胞膜上原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号
使用分离的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化
蛋白间的互作信号依赖泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动,
而不是靠转录,因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列

欧易特色

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提供内容

实验报告:详细实验流程、各阶段电泳图、文库库容量、插入片段长度鉴定图等
文库质粒100μg以上
Gateway体系可提供初级、次级文库质粒及菌液

案例展示

膜体系——纤维素酶KORRIGAN纤维素合成酶复合体的成员


研究背景
植物生长和器官形成取决于负载的纤维素微纤丝在细胞壁中的定向沉积。纤维素是由大分子的纤维素合成酶复合物(CSC)合成的,它含有至少三种不同的纤维素合酶。植物和细菌中的纤维素合成也需要有活性的内酯-1,4-B-D-葡聚糖酶,但其在合成过程中的确切功能尚不清楚。
研究内容

KORRIGAN1 (KOR1)是定位在质膜上的内酯-1,4-B-D-葡聚糖酶。在其突变体中,植物一方面无法将CSC移动到细胞膜处;另一方面,纤维素合成酶抑制剂CGA3259615的活性也受到影响。结果表明KOR1对纤维素的合成具有重要作用。同时,作者还利用多种手段,发现KOR1是植物细胞壁CSC的组成部分。KOR1和CESA共定位在质膜和高尔基体,并通过膜体系酵母双杂和BiFC证明了二者的相互作用。

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KOR1与CESA1,CESA3和CESA6相互作用


研究结果
1. 在野生型中,CESA3的质膜上的移动速度是253 nm min-1。而在kor1-1中,其移动速度下降为147 nm min-1。另外,CGA处理后,CESA3在质膜上的积累也受到抑制,突变体中这种异常积累更加显著。结果表明KOR1对CSC的正常移
动和正确的定位具有重要功能。
2. 凝胶过滤实验表明,在拟南芥中KOR1和CESA1定位在同一个大分子量复合物中。而在棉花中,KOR1定位在纤维发育相关的一个复合物中。
3. 构建35S驱动GFP-KOR1融合蛋白表达载体,说明GFP-KOR1定位在质膜上。进一步通过与FM4-64的共定位验证这一结果。另外,亚细胞定位还证明,GFP-KOR1定位在高尔基体中。
4. GFP-KOR1在质膜上的移动速度为280 nm min-1,与GFP-CESA3 和GFP-CESA6的移动速度相似(分别为277 nm min-1和272 nm min-1)。另外,GFP-KOR1和GFP-CESA3的运动轨迹与微管重叠。以上结果说明GFP-KOR1与表皮细胞伸长
过程中微管的再定位有关。
5.表皮细胞中,GFP-KOR1与mCherry-CESA1在质膜上共定位。进一步用安磺灵处理,发现GFP-KOR1的移动并未受到影响,表明其移动不依赖于微管发生。
6.分裂泛素系统证明,KOR1能够与CESA1、CESA3和CESA6相互作用。并经一步通过BiFC验证了这一结果。

参考文献

Vain T, Crowell EF, Timpano H, et al. The Cellulase KORRIGAN Is Part of the Cellulose Synthase Complex. Plant Physiol 2014; 165(4), 1521-1532. (IF: 6.841).


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