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简化基因组甲基化测序MethylRAD-Seq

简化基因组甲基化测序MethylRAD-Seq介绍

Methyl RAD技术(Wang et al., Open Biol., 2015)使用了甲基化修饰依赖性内切酶,如FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI等,此类内切酶会识别DNA上发生甲基化的胞嘧啶,在识别位置的下游隔一定距离切割双链。若DNA双链具有中心对称甲基化状态,则可以切割产生一个固定长度的双链DNA片段。对酶切产生的标签建库测序,即可进行甲基化位点的定性和相对定量分析。


欧易特色

● 文库构建简便快速,不经过片段大小选择,保证了实验的重复性

● 具有极强的灵活性,标签密度可控

● 标签长度一致,PCR扩增效率一致,测序深度均一

● 具有单碱基分辨率,可以做到甲基化位点的定性和相对定量分析

● 甲基化位点检测的假阳性率能够控制在0.50%以内(WGBS假阳性率在0.28%-0.50%)

● 提供标准和高级生物信息分析,可根据客户需求提供个性化数据分析

● 所需的样本DNA起始量极低

● 有参无参物种均可,既可用于未知甲基化位点的开发,也可用于不同样本间的甲基化位点的差异研究


简化基因组甲基化测序MethylRAD-Seq项目流程

methylrad流程


推荐测序模式

● Hiseq X-Ten,PE150 

● 30 M reads/1 G基因组大小


简化基因组甲基化测序MethylRAD-Seq样品要求

● DNA总量≥1μg、OD260/280为1.8-2.0

● 请提供每个样品具体的浓度、体积、提取时间,同时附上电泳检测胶图、分光光度计或者Nanodrop仪器检测数据等

● 样品需经过纯化,尽量减少多糖、蛋白质、RNA等残留,同时应避免样品间的污染


数据分析内容

标准数据分析

● 数据质控  ·去接头污染  ·过滤低质量reads   ● reads产出情况统计   ● reads与参考基因组比对


高级数据分析

测序数据的全基因组分布趋势

· reads在全基因组每条染色体上的分布(该项分析只针对染色体信息齐全的物种) · reads在CG、CHG位点上的覆盖深度

· reads在不同基因功能元件上的分布(需基因组注释信息)

· reads在基因元件及其上下游2,000 bp的平均覆盖深度分布趋势(需基因组注释信息)

● 甲基化位点信息分析

· 统计CG和CHG的甲基化位点及数目 · 甲基化位点水平的相对定量

· 统计甲基化位点在不同基因功能元件上的分布(需基因组注释信息)

● 全基因组甲基化差异分析

· 差异甲基化位点的筛选统计 · 差异甲基化位点在不同基因功能元件上的分布(需基因组注释信息)

· 分析两组样品间的甲基化水平差异位点的相关基因(需基因组注释信息)

· 对两个样品间的差异基因进行功能注释(需基因组注释信息)


常见问题

● 1. Methyl RAD技术中使用的是什么类型的酶?
以其中一种内切酶FspEI为例,其识别序列为5’-CC-3’,且第二个胞嘧啶需发生甲基化,在此胞嘧啶所在链的右侧第12个碱基处、反向链右侧第16个碱基处进行切割,此时若反向链中心对称位置上存在同样的识别位点,则可切割产生Methyl RAD标

内切酶FspEI的识别及酶切位点

内切酶FspEI的识别及酶切位点

● 2. Methyl RAD检测到的甲基化位点数量如何?
Methyl RAD技术文章(Wang et al., Open Biol., 2015)中有Methyl RAD 和WGBS在拟南芥中检测到的CCGG和CCWGG两种甲基化位点的数量对比,从中可以看出二者的检出数量吻合度非常高。

Methyl RAD、W GBS检测到的甲基化位点数量对比

Methyl RAD、W GBS检测到的甲基化位点数量对比
(a、b图中的三行分别对应:基因组上预测出来的、WGBS检测到的、MethylRAD检测到的CCGG/CCWGG位点)

● 3. 如何调整标签密度?
Methyl RAD技术既可以增加标签密度,也可以降低标签密度。增大密度:可同时使用两种或两种以上的内切酶进行建库测序;降低密度:酶切后产生的片段为粘性末端,并且粘性末端的碱基是随机的。因此,在对酶切片段连接接头的过程中,可通过选择性接头特异地选择部分标签进行建库,以达到降低密度的目的。


参考文献


Wang S, Lv J, Zhang L, et al. MethylRAD: a simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylat ion-dependent restriction enzymes. Open Biol. 5, (2015). (IF: 4.822)

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