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微生物多样性:16S/18S/ITS等扩增子测序

微生物多样性检测介绍

微生物多样性测序是基于第二代高通量技术对16S rRNA/18S rRNA/ITS等基因序列进行测序,能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测,获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。


欧易特色

● 灵活的研究方案:针对客户的不同研究需求提供灵活多变的研究方案
● 专业严谨的服务:专业成熟的样本制备、建库以及数据分析流程,客观还原样品本身的菌群结构以及丰度
● 专业的复杂样本处理能力:针对大量的样本以及分组复杂的样本,具有清晰的逻辑处理思路,专业的分组对比分析能力
● 个性化定制分析:针对客户提出的个性化分析需求,提供专业的分析服务。针对客户的研究目的和需求提供专业的个性化定制分析建议


微生物多样性检测项目流程

微生物多样性检测流程


推荐测序模式

● Miseq


数据分析内容

标准数据分析

● 原始测序数据预处理   ● 稀释曲线(Rarefaction Cur ve)   ● OTU划分&OTU注释&物种分类注释   ● 物种系统发育树

● 多样性指数分析   ● 物种组成统计热图   ● 群落结构:OTU分类   ● 物种丰富程度&均匀程度(Rank Abundance曲线)

● 主成分分析(Principal component analysis, PCA)


高级数据分析

● 多样品OTU分布网状图(Network)   ● 单因素方差分析   ● 多样品O TU分布比较(Venn图)

● 多样品(微生物群落)分层聚类UPGMA    ● 样本聚类UP GMA可靠性Support分析

● 主坐标分析PCoA(2D/3D)图   ●  基于Unifrac 距离的箱型图(Box-Plot)分析

● 含分类单元主坐标分析PCoA图(3D Bi-Plot)   ● 差异对比NMD S分析

● 冗余分析RDA(线性模型)/典型对应分析CCA(单峰模型)   ● 含多样品分类饼图

● LEfSe分析(组间比较分析)   ● Adonis组间比较分析(基于Unifrac距离矩阵)


微生物多样性检测样品要求


● DNA:PCR能批出条带即可
● 土壤、底泥:5-10 g
● 水体:1-3 L水样用0.22 μm滤膜过滤
● 粪便:3 g,为避免污染,建议先排尽尿液,用无菌勺子取粪便内部样品
● 黏膜:指甲大小(约0.8 cm * 0.8 cm)
● 肠道内容物:用无菌解剖刀,在无菌状态下取出腹腔肠道并用PBS冲洗
● 血液:10 mL,可使用无菌采血针,保存在EDTA漂洗微量管中
● 叶片表面:50-100 g。用无菌水冲洗,冲洗以后收集无菌水用滤膜过滤
● 物体表面微生物样本:将物体置于无菌容器内,加入适量的PBS浸没物体,利用摇床等仪器旋转震荡,使物体表面微生物与物体脱落,收集水样,低温高速离心,收集沉淀
● 口腔样本:采用拭子形式或漱口水形式提供,唾液可直接进行收集后送样


常见问题


● 1. 哪些环境样品可以进行微生物多样性检测?

针对宿主的相关样品,如皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等;针对环境的相关样品,如土壤、水体、空气、盐湖、沼泽等,均可进行微生物多样性检测。


● 2. 进行环境微生物多样性测序一般可以鉴定到物种的哪个分类水平?

一般用16S rRNA基因测序可以分类到属的级别,现有的rRNA序列数据库提供的物种分类软件也只支持鉴定到属的级别。这主要是因为16S r RNA序列在某些物种间差别非常小,加上测序固有的错误率存在,我们如果降低取信要求,鉴定到种,能够使用的序列过少,鉴定的结果可靠性也会降低。


● 3. 如果我想关注某些特定的菌,比如甲烷氧化细菌、固氮菌等。进行16S rRNA测序可否注释一下哪些菌属于这类菌的范畴?

可以。我们公司的标准分析项目包含各个样本中物种的注释,标准分析结果中会给出含有物种注释的文件。研究人员可以在此基础上挑选出感兴趣的物种,但标准分析中并不包含挑出特定物种进行丰度图的绘制以及热图等的绘制。若研究人员有此需求,为定制化分析(属于高级分析项目)。


● 4. 环境微生物多样性测序的应用领域?

环境微生物多样性测序的应用领域非常广:包括疾病诊断、疾病机理、药效评价、药物机理等医药方面;环境微生物差异研究、生物地理学研究等环境生态学方面;植物保护、连作障碍、作物生长与根际微生物关系等植物科学方面;动物肠道微生物研究等动物科学方面;污水处理、油污利用、酿酒微生物研究等工业应用方面;还有某些重要次生代谢物相关的环境微生物多样性研究等。


● 5. Miseq平台的优势在哪儿?它和Hiseq的区别在哪儿?
Miseq可以说是新一代小型化的“椅上型”(bench-top)测序仪的代表,备受期待。Miseq因其卓越的性能和小型化的优势,潜在的应用领域十分广泛,已不再局限于传统的生物实验。Hiseq和Miseq的确有许多相同之处。它们所使用的技术很多是一样的。不过它们之间也有很多不同点,从一开始,Miseq就是以新一代个人化测序仪的定位来设计的。Hiseq的设计理念是追求最高的通量,尽可能读出更多的DNA序列。而Miseq的设计意图却有所不同,它的追求是效率:它可以在一个8小时的工作日内,从DNA开始分析一个样本,并获得最终结果。在这样短的时间内就完成了一个完整的工作流程。至于这个测序系统有多迅速,具体地说,Miseq的一个测序循环只要5分钟,而Hiseq的一个循环则需要40分钟。然后是把这些性能都整合到一个小型的椅上型系统中去:所有的功能,从反应簇的生成到测序序列和索引的读取,以及后续的数据分析都由一个设备来完成,从建文库到出结果报告是一个衔接流畅的过程。此外,简单易用也是Miseq的一大特点,因为所有功能都整合在一起了。Miseq的产生是建立在一系列不可或缺的技术改进之上的,包括在化学、分析工具、数据存储和样品制备技术上的进步,使得测序的准确性提高,读长更长,通量更高。


案例展示

案例一:熊蜂肠道微生物特定生态型

研究背景:

熊蜂具有简单而特异的肠道微生物类群,主要由几个新描述的细菌物种组成。到目前为止,在已研究的其他蜜蜂肠道中没有发现这些新细菌。虽然熊蜂的肠道菌群比较简单,但它的肠道菌群和哺乳动物有相似之处。第一,两者都是社会性传播。第二,具有保守的肠道核心菌群。第三,肠道微生物在寄主个体间差异很大。这种变异可能反映了微生物与其寄主间的长期协同进化。中国具有世界上最丰富的熊蜂物种(大约125种),占全世界的一半,因此,熊蜂是研究肠道微生物、动物宿主以及环境复杂互作的一个重要的模式昆虫。


研究内容:

欧易生物携手中国农业科学院和中国科学院昆明动物研究所,对我国7个地区的28种熊蜂,共142只工蜂的肠道细菌的16S rRNA基因的V6-V8区进行454 焦磷酸测序,并结合经典生态学的分析方法进行分析。研究揭示了熊蜂肠道微生物组具有两种固定的生态型(Enterotypes),这是继发现人类和大猩猩的肠道微生物存在特定生态型后首次在传粉昆虫熊蜂上发现的,为今后深入研究传粉昆虫生物学提供了肠道微生物新视角。

熊蜂肠道微生物存在两种保守的生态型(PCA分析)
两种生态型中属水平上菌群相对丰度的箱线图(B图)和热图(C图)
熊蜂肠道微生物存在两种保守的生态型
两种生态型中属水平上菌群相对丰度的箱线图(B图)和热图(C图)
研究结果:

● 1. 基于Calinski–Harabasz (CH)指标,熊蜂肠道微生物存在两种保守的生态型。大部分样品(73%)属于第2种生态型,这种生态型是由Gilliamella 和 Snodgrassella菌群组成,这两类菌群在蜜蜂中也存在。Gilliamella 和 Snodgrassella可能会通过抵抗病原菌的侵袭和营养物质的消化吸收来影响熊蜂的健康。另一种生态型主要是由环境性菌群组成,而且含有一些条件致病菌如哈夫尼菌属(Hafnia)和沙雷氏菌属(Serratia)。

● 2. 定量PCR结果表明,肠道细菌16S rRNA基因的绝对拷贝数为1.2 x 10 8 (± 1.1 x 10 8),每个肠道大约有3 x 10 7细菌细胞。

● 3. 两种不同生态型在熊蜂肠道微生物中的出现显示出与哺乳动物肠道微生物生态型分化的高度一致,对于熊蜂物种的健康和种群动态具有潜在的影响,为进一步挖掘这些特定肠道共生菌的功能奠定了基础,同时也为我国蜂种资源的多样性保护提供参考。



案例二:婴儿的肠道菌群可预测坏死性小肠结肠炎的发生

研究背景:

坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种严重的肠道疾病,影响约百分之十的低体重早产儿,常导致婴儿死亡。之前有研究报道肠道微生物与坏死性小肠结肠炎之间没有相关性;也有研究提出某些肠道微生物(如丙酸杆菌、双歧杆菌)可以阻止坏死性小肠结肠炎的发展。这种矛盾的结果可能是由于婴儿肠道微生物的动态变化,以及样本数偏少(平均3个)造成。本研究通过大量样本来评估后来患坏死性小肠结肠炎的婴儿(病例组)和没有患病(对照组)的婴儿肠道微生物的不同。



研究内容:

研究人员共招募了两个研究队列,共计972名婴儿。第一队列是研究人员用四年时间(2009-2013年)招募的来自圣路易斯儿童医院的出生体重极低(≤1500g)的婴儿(489名);第二队列是研究人员用两年时间(2011-2013年)招募的分别来自库萨儿童医院(276名)和俄克拉何马大学儿童医院(207名)的出生体重极低(≤1500g)的婴儿。研究人员收集和冻存了所有婴儿的粪便样本。如果婴儿的临床特点与坏死性小肠结肠炎一致,并且其X光片符合标准的贝尔第2或3阶段的坏死性小肠结肠炎,则这些婴儿被定义为患病婴儿。在确定患病婴儿后,选择与患病婴儿来自同一家医院、具有相似胎龄、出生体重和出生日期的婴儿作为对照(每个病例组1-4名对照,比率不固定)。从婴儿粪便样本提取DNA进行16S rRNA基因(V3-V5区)扩增,然后进行焦磷酸测序。通过Dirichlet多项分析和混合模型,研究人员发现了坏死性小肠结肠炎发展以及其他宿主影响因子与肠道微生物的关系。

纲水平上四种主要细菌在第一队列的分布

水平上四种主要细菌在第一队列的分布

研究结果:

● 1. 研究人员分析了第一队列的122名低体重婴儿的2492份粪便样本,其中28名婴儿出现坏死性小肠结肠炎,94名没有患坏死性小肠结肠炎的婴儿作为对照。结果发现,患坏死性小肠结肠炎的婴儿的微生物群落结构与没有患坏死性小肠结肠炎婴儿的显著不同,这些不同只出现在新生儿出生一个月后


● 2.在混合模型中,随时间变化的坏死性小肠结肠炎与γ-变形细菌呈正相关(p=0.0010),与严格厌氧菌尤其是Negativicutes呈负相关(p=0.0019)


● 3. 研究人员研究了第二队列的44名婴儿的 1094例粪便标本,其中18名婴儿患坏死性小肠结肠炎,26名没有患坏死性小肠结肠炎的婴儿作为对照


● 4. 将两个队列的数据(166名婴儿,3586例粪便,46例坏死性小肠结肠炎)整合到一个混合模型中,患坏死性小肠结肠炎的婴儿与对照组相比,γ-变形细菌的比例增加(p=0.0011),Negativicutes(p=0.0013)和联合Clostridia–Negativicutes的比例都降低(p=0.0051)。上述结果只是在第一队列和整合队列中不足27周妊娠出生的婴儿中最显著


● 5. 在出生体重极低的早产儿中,γ-变形细菌(如,革兰氏阴性兼性杆菌)的相对丰度和严格厌氧菌(特别是Negativicutes)的相对缺乏,在坏死性小肠结肠炎发生之前就已出现。这些发现为预防那些不足27周妊娠出生的婴儿患坏死性小肠结肠炎提供了潜在的目标


案例三:生物电化学脱氧系统中的直接电子转移到电化学活性的细菌(1)

欧易生物携手浙江大学,研究微生物电化学系统( BES)中的阴极电子转移机制。为了分析得到生物阴极的哪些细菌菌群具有关键作用,采用16SrRNA测序。对测序结果进行聚类分析,发现所有菌群可以分成7个门,其中3个门菌群占据主导地位,分别为变形细菌门( Proteobacteria)、拟杆菌门( Bacteroidetes)和厚壁菌门( Firmicutes),共占据所有细菌的95.38%。根据以往的报道,这3个门的菌群是不同的生物阴极的主要成员。经过分析发现,变形细菌门细菌与Fe-氧化有一定关系,其有能力将Fe(II)转移电子到电子受体,所以作者认为,变形细菌门细菌能够使用电极作为电子供体。

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案例四:肠道微生物驱动激素依赖性来调节自身免疫在不同性别中的差异(2)

微生物暴露和性激素水平对自身免疫性疾病有着强有力的影响,其中许多影响在妇女中更为普遍。本案例对1型糖尿病(T1D)中非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型进行研究,验证了在生命周期的早期阶段的微生物暴露限制了性激素水平并且修饰了自身免疫的进展。本实验中研究了不同处理下的小鼠肠道微生物的差异,采用16S rRNA测序,对在Family分类水平下的最高丰度的前30个物种进行PCA分析。分别对3周龄、6周龄的以及14周龄的NOD雄性小鼠以及无特定病原体(SPF)的雌性小鼠(6组*5 sample)进行肠道菌群分析,PCA显示出了组间的差异性。


参考文献

(1)Li J, Powell JE, Guo J, et al. Two gut community enterotypes recur in diverse bumblebee species. Curr Biol. 25, R652-653 (2015). (IF: 8.983)
(2)Warner BB, Deych E, Zhou Y, et al. Gut bacteria dysbiosis and necrotising enterocolitis in very low birthweight infants: a prospective case-control study. The Lancet. 387, 1928-1936 (2016). (IF: 44.022)

(3)Liu D, Lei L, Yang B, et al. Direct electron transfer from electrode to eletrochemically active bacteria in a bioelectrochemical dechlorination system. Bioresource Technology. 2013;148:9-14

(4)Markle J, Frank G, Mortin-Toth S, et al. Sex Differences in the Gut Microbiome Drive Hormone-Dependent Regulation of Autoimmunity. Science. 2013;339(6123):1084-1088.

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