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三代全长转录组测序
PacBio Sequel的长读长可实现全长转录本测序,并使基因可变剪接形式的识别成为可能,因此可以对新基因及其Iso-form进行多方面研究。同时,长读长不再需要对RNA-Seq的Reads进行组装,因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行多方面注释,用以改进参考基因组中的基因注释信息。
文库构建流程
PacBio Sequel系统使用的全长转录组建库有SMARTer®和SuperScript®两种方式。经过对仪器和试剂的调试,欧易使用效率更高的Clontech公司的SMARTer® PCR cDNASynthesis Kit进行建库。
相比前代RS系列测序仪,Sequel系统在SMRT Cell片段长度偏好性方面已经有很大改进,4 kb以下的建库无需进行片段大小选择。

微信截图_20181114101801

分析流程

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Sequel数据分析流程示意图
数据分析内容
Iso-seq分析包含4个主要的步骤,分别是CCS,Classify,Cluster和Subset(可选)
CCS步骤
该步骤主要基于来自同一条Polymerase Read中的Subreads序列构建CCS序列
Classify步骤
该步骤通过分析CCS序列,输出两个文件
一个文件包含全长非嵌合体序列(Full-length Non-chimeric Reads)和非全长序列
在该过程中,Classify步骤会去除CCS序列中包含的PolyA/T Tails和Primer序列,去除污染序列,但是会保留PCR引起的嵌合体序列
Cluster步骤
该步骤基于全长非嵌合体序列和非全长序列,进行质量校正处理,生成Polished高质量的一致性序列和低质量一致性序列
Subset步骤
这是一个可选步骤,主要用于从输出文件中将指定类型的序列输出出来,比如非嵌合体Reads等

根据测序样本对应参考基因组的有无,会有分析内容上的差异。如果进行三代全长转录组测序的同一批样本有二代转录组测序的数据(或同时进行二代转录组测序),则可以将二、三代转录组测序的数据结合进行分析,增加表达差异信息。
*欧易公司最近对分析流程进行升级,无参全长转录组测序也能够进行可变剪接分析。
案例展示
在真核生物中,大多数基因都可以通过选择性剪接产生多种转录本,大大提高了基因组的蛋白质编码潜力[1]。来自相同基因的可变剪接产生的不同转录本可能具有显著差异,甚至拮抗作用[2]。短读长的RNA-seq不能跨越转录物的全长,难以整体表征转录本异构体的多样性[3]。Iso-Seq可以直接检测转录本的全长,消除了使用算法对转录本进行拼装的步骤。Iso-Seq方法能够获得与目标基因或整个转录组中的转录本有关的可变剪接的外显子和转录起始位点的准确信息及多聚腺苷酸化位点的信息。
人类相关研究中的RNA测序
因为大多数人类基因都存在可变剪接[1],所以知道哪个Iso-form在样品中表达是准确研究和分析的关键。单个基因可能编码惊人数量的蛋白质,且在某些情况下具有相反的生物学功能[4]。剪接突变已经与各种疾病表型相关联,许多人类疾病与可变剪接异构体水平的变化有关(List of Diseases)。从短读长数据进行转录本拼装缺乏敏感性和特异性,这导致RNA测序数据的解释复杂化[5]。
Iso-seq在人转录组研究中的亮点
直接进行全长转录本测序,无需进行转录本拼装
对转录多样性进行广泛或有针对性的研究,以获得关于替代转录的频率和类型的关键信息
特异性地观察等位基因的表达
区分细胞、组织和疾病状态之间的Iso-form表达
特色研究:在良好表征的细胞系中发现新的Iso-form[6]科学家在人类胚胎干细胞系中共发现了2,428种新型异构体,其中216种新型基因表现出差异表达。该研究同时证明三代Iso-seq能够提高二代RNA-seq数据的定量准确度。

3

鉴定前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPR)中的新型Iso-form
直接进行全长转录本测序,无需进行转录本拼装
对转录多样性进行广泛或有针对性的研究,以获得关于替代转录的频率和类型的关键信息
特异性地观察等位基因的表达
区分细胞、组织和疾病状态之间的Iso-form表达

4

上图为使用长读序列来鉴定和量化在CRPC中表达的全长雄激素受体(AR)Iso-form
确定了截短的Iso-form AR-V9,其显示出比AR-靶向治疗的主要抗性AR-V7更具预测性的生物标志物



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