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small RNA测序

small RNA测序介绍


Small RNA(包括miRNAs、siRNAs和piRNAs等)是生命活动中重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱发挥着重要的作用。基于Illumina高通量测序平台的small RNA测序技术不受物种限制,具有高灵敏度和高精确性,既能鉴定特定条件下表达的miRNA,也能发现新的miRNA。同时还可用生物信息学分析筛选在特定条件下差异表达的miRNA。


欧易特色


● 高度灵活性:可研究任一17~35 nt之间小RNA分子
● 高度精确性:可精确到单核苷酸水平,非常有利于区分高度同源的小RNA分子和鉴定小RNA的多态性
● 检测动力学范围广:可在超过6个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析,有利于低丰度小RNA差异表达的研究
● 数据质量高:深度测序保证了抽样随机性,可靠性和重复性高,与实时定量PCR结果具有较高的一致性


small RNA测序项目流程


Small RNA测序流程


数据分析内容


标准数据分析

small RNA测序数据预处理 ·数据处理统计 ·Reads长度分布统计·Reads拷贝数统计

● 序列比对注释高质量Ref tag构建

·参考基因组比对 ·miRBase数据库比对注释·Rfam数据库比对 ·Gene比对 ·Repbase比对·Reads分类注释汇总

● 已知miRNA鉴定  ● 新miRNA预测·新miRNA预测 ·新miRNA二级结构预测

● miRNA差异分析(已知/新预测)·miRNA表达量统计 ·miRNA差异筛选

● 差异miRNA靶基因预测(已知/新预测)

·差异miRNA靶基因预测
·差异miRNA靶基因GO富集分析
·差异miRNA靶基因KEGG富集分析


small RNA测序样品要求


● Total RNA:≥2 μg , 浓度≥400ng/μl

● OD260/280为1.8-2.2

● 适用范围:真核生物(有、无参考基因组皆可)


常见问题


● 1. Small RNA测序后进行RT-PCR验证时,常会出现非特异性扩增,如何解决?
因为miRNA序列比较短,彼此间相似度又非常高,尤其是同一家族的miRNAs,彼此间可能只有1个碱基差异,出现非特异性扩增是很正常的,建议使用Taqman探针法进行尝试。


● 2. 没有参考基因组可否进行small RNA测序?
进行生物信息分析时,针对有参考基因组样本,以该物种的基因组以及该物种的miRBase数据库为参照进行数据分析;如果没有参考基因组,可以近缘物种的基因组以及近缘物种的miRBase数据库为参考,或者动物样本以所有动物的miRBase数据库、植物样本以所有植物的miRBase数据库为参照进行比对分析。


● 3. Small RNA测序对样本有什么特殊要求?
为防止small RNA丢失,浪费样本、时间和精力,抽提total RNA时请使用miRNA Homogenate Addit ive。如果同一份样本同时检测mRNA/lncRNA和small RNA,请事先告知该区域负责的销售工程师,请公司抽提人员注意保留small RNA。


案例展示

案例一:Small RNA测序分析牛乳腺炎发生机制

研究背景:
牛乳腺炎是一种在牛乳腺发生的、由持久性病原体(例如金黄色葡萄球菌和链球菌)引发的炎症反应,一直被乳品行业认为是最重要的疾病之一。对于牛乳腺炎的控制,行业工作者做出了极大努力,包括研究宿主侵染病原菌后的反应机制、适当的控制发展进程等。有研究报道称,miRNA在炎症反应中具有重要的调控作用,但多数研究集中在细胞水平,关于机体本身研究甚少,尤其是牛侵染病原菌后的炎症免疫反应研究。


研究内容:
本研究以牛为研究对象,欧易生物携手扬州大学采用small RNA测序技术分析侵染金黄色葡萄球菌、并形成乳腺炎的牛乳腺组织和正常乳腺组织的差异miRNAs,并对差异miRNAs进行靶基因预测和功能富集分析,结果表明差异miRNAs与细胞调控、胞吞、嗅觉传导和免疫过程相关,这些研究结果为揭露乳腺炎的发生和调控机制提供了实验基础,为miRNAs作为奶牛乳腺炎诊断的biomarker提供了可能。

牛正常乳腺组织和乳腺炎组织的组织学鉴定

牛正常乳腺组织和乳腺炎组织的组织学鉴定

乳腺炎组 vs 正常组的差异表达miRNAs

乳腺炎组 vs 正常组的差异表达miRNAs

研究结果:
● 1. 本研究以侵染金黄色葡萄球菌、并形成乳腺炎的牛乳腺组织和正常牛乳腺组织为研究对象,进行small RNA测序检测。通过生物信息学分析,正常组鉴定获得358个已知成熟体miRNAs、488个已知前体miRNAs、232个新miRNAs;乳腺炎组鉴定获得370个已知成熟体miRNAs、511个已知前体miRNAs、341个新miRNAs。


● 2. 为获得乳腺炎组的特征性miRNAs,进行组间差异筛选,结果发现相较于正常组,乳腺炎组有77个差异表达miRNAs(FC≥2,P≤0.05),从差异miRNAs中选择10个miRNAs进行RT-PCR验证,结果发现RT-PCR结果与small RNA测序结果非常一致。


● 3. 通过靶基因预测分析,77个差异miRNAs共获得19792个靶基因,对靶基因进行GO和KEGG功能富集分析,发现靶基因与催化激活、免疫过程、微生物代谢、胞吞、嗅觉传导有关。


案例二:利用Small RNA测序技术分析鉴定小立碗藓的siRNA形成机制

研究背景:
多数植物的small RNA是在序列上特异性靶向mRNA的负调控子。在被子植物中,具有两种含量非常丰富的內源性small RNA分子,分别是长度约21 nt的miRNAs和24 nt的siRNAs,其中siRNAs来源于重复序列,能增强靶向位点的DNA甲基化程度。但在其他陆地植物中,siRNAs特性还不明晰。


研究内容:
为了分析小立碗藓的miRNAs和siRNAs特性,研究人员利用small RNA测序结合WGBS技术检测小立碗藓的野生型和突变体,鉴定小立碗藓的siRNAs和miRNAs特征表达谱,并分析了siRNAs形成位点与甲基化的关系,结果表明:mDCL参与了小立碗藓內源siRNAs形成,促进23 nt的siRNAs富集;虽然siRNAs对其形成区域DNA甲基化的改变很小,但抑制了体内LTR逆转录相关基因的表达。

小立碗藓small RNA 类型分析

新注释方法鉴定获得的miRNA以及新老两种方法比较

新注释方法鉴定获得的miRNA以及新老两种方法比较

新注释方法鉴定获得的miRNA以及新老两种方法比较

研究结果:
● 1. 分析鉴定1090个可以形成长度23-24 nt siRNAs的位点,这些位点绝大多数在DNA甲基化富集的基因间区。
● 2. 新的miRNA注释方法鉴定获得130个miRNAs,其中112个是已知的、3个是已知miRNA家族的新成员、15个来源于新的
miRNA家族;比较新老注释方法,发现两种注释方法共同分析获得的有114个miRNAs。
● 3. 对小立碗藓的mdcl突变体分析发现,mDCL参与了小立碗藓的內源siRNA形成,促进23 nt的siRNAs富集。
● 4. 经过WGBS分析显示,尽管小立碗藓的內源siRNA对形成区域的DNA甲基化改变很小,但抑制了体内LTR逆转录相关基因的表达。


案例三:small RNA测序揭示miRNA调控鲤鱼皮肤色素沉积

欧易生物携手上海海洋大学,运用small RNA测序技术,对两种不同体色的鲤鱼进行small RNA测序,通过分析不同体色的鲤鱼皮肤中差异表达的miRNA,并从中挖掘了与鱼类体色决定相关的miRNA,为鱼类体色决定机制的研究奠定了基础。

small RNA测序案例:small RNA测序揭示miRNA调控鲤鱼皮肤色素沉积-欧易生物
图1. 正常脂肪样本、高分化与低分化的脂肪肉瘤样本的聚类分析不同体色的鲤鱼皮肤中差异表达的miRNA


案例四:不同环境和处理条件下水稻不同组织的miRNA测序

该研究采用miRNA测序技术,对62个来源于不同环境和处理条件的不同水稻组织进行了miRNA测序,鉴定了76个新的水稻miRNA,分析了水稻种子、根、芽和穗部的miRNA表达差异,发现了组织特异性表达的miRNA,为水稻发育调控以及环境适应研究奠定了基础。

small RNA测序案例:不同环境和处理条件下水稻不同组织的miRNA测序-欧易生物
图2. 水稻穗部特异性表达的miRNA

参考文献

1.Li R, Zhang CL, Liao XX, et al. Transcriptome microRNA profiling of bovine mammary glands infected with Staphylococcus aureus. Int J Mol Sci . 16, 4997-5013 (2015). (IF: 3.257) 

2.Pecoraro C, Babbucci M, Villamor A , et al. Methodological assessment of 2b-RAD genotyping technique for population structure inferences in yellowfin tuna (Thunnus albacares). Mar Genomics. 25, 43-48 (2016). (IF: 8.538)

3.Jeong D, Park S, Zhai J, et al. Massive analysis of rice small RNAs: mechanistic implications of regulated microRNAs and variants for differential target RNA cleavage. The Plant cell. 2011; 23 (12):4185-4207.

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