欧易生物

热门搜索关键词:转录组基因组甲基化酵母文库蛋白芯片

021-34781616

联系欧易

服务热线:021-34781616
  • 客服QQ:1019235790
  • 邮箱:market@oebiotech.com
  • 公司地址:上海市闵行区浦江镇新骏环路138号2幢4层

当前位置:首页 » 基因组 » 捕获测序

捕获测序

捕获测序介绍

捕获测序是随着二代测序技术的应用而产生的一种序列捕获技术。根据捕获的目标序列可以分为外显子组测序和靶向捕获测序。
外显子组捕获测序通过外显子组测序定位与蛋白质功能变异相关的基因变异。相比全基因组测序,外显子组测序更加经济、高效。
靶向捕获测序靶向捕获测序又称为目标区域测序,是对研究者感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获,富集后进行高通量测序。通过目标区域测序,可以定位与特定性状相关的候选基因。


靶向捕获测序根据捕获技术不同,又可分为两类:
● 扩增子测序:采用PCR手段对目标区域进行扩增,然后针对扩增产物进行深度测序。基于扩增测序的捕获产品包括:Qiagen、Illumina TruSeq Amplicon panel。
● 基于芯片杂交的捕获测序通过定制针对感兴趣的基因组区域的探针,与基因组DNA进行杂交,将目标区域DNA富集后进高通量测序。基于这一策略的捕获平台包括:Agilent SureSelect平台、Roche NimbleGen平台。


欧易特色

● 根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案
● 探针设计完全自由,物种和区域大小没有绝对限制,只需提供目标区域相关信息和参考基因组信息
● 探针长度超过100 bp,对于片段缺失的容错率可达25 bp,有效捕获目标片段
● 提供多种预设探针方案,如全外显子、UTR等
● 提供标准和高级生物信息分析,可根据客户需求提供个性化数据分析
● 特殊样本操作经验丰富:FFPE、血液、显微切割样本


捕获测序项目流程

捕获测序流程


推荐测序模式

● Hiseq4000,PE150?

● 大于目标区域200 X测序量


数据分析内容


标准数据分析

● 数据质控 ? ● 捕获质量、覆盖度和均一性分析

● 数据比对 ? ● 变异分布统计

● 编码区和非编码区SNP/InDel检测、统计、注释

● 变异类型和发生区域统计 ● 密码子和氨基酸变化统计

● 碱基替代类型和比例统计 ● 各基因变异分布统计


高级数据分析

● 群体进化研究 ?·群体遗传多样性指数计算 ·主成分分析(PCA) ·个体聚类分析、群体聚类分析

● 遗传图谱构建 ? ● 群体遗传结构分析

● QTL定位 ??● 关联分析


捕获测序样品要求


● DNA总量≥3 μg (qubit),<200 ng 可微量建库

● 样品体积大于10 μl ● OD260/280为1.8-2.0


常见问题


● 1. 捕获测序必须要有参考基因组吗?
必须有,以确保捕获结果的可靠性。如果没有参考因组,要提供近缘物种的序列,但不能保证捕获结果的可靠性。因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的,如果已知目标区域与参考基因组比有较大出入,例如大片段的插入缺失,是不推荐的。


● 2. 何时选择定制探针捕获?何时选择全外显子捕获?
人类和一些常见物种的全外显子捕获都有预设的探针产品,其中人类全外显子探针已优化过多个版本。如果目标区域很多且均为外显子(几十M以上),建议直接选择全外显子捕获,因为全外显子有设计更成熟的探针组和更低的成本,捕获效果更好。对于较小的目的片段,或者也关注外显子以外的区段,建议采用定制探针。


● 3. 能否捕获多物种混合的样品?
可以,只要捕获的目的片段有相应的参考基因组,就能够被探针捕获到。例如宿主基因组中整合的病毒序列、血液中混合的寄生虫序列、环境样品中的低丰度微生物序列等等。由于这些序列在混样中所占的比例往往很低,使用传统的重测序方法的效率会非常低,需要非常高的测序量才能得到足够的覆盖深度,同时会产生大量的冗余数据。捕获测序在这方面具有绝对的优势。


案例展示

案例一:全外显子捕获测序有效鉴定由EMS诱发的突变

研究背景:

虽然测序成本在不断降低,但目前大规模进行基因组测序仍需要较高的费用,特别是基因组较大的物种。全外显子测序能够将测序目标限定在基因组的编码部分,在动植物中有非常广泛的应用,对突变群体中突变位点的发现也有很高的应用价值。

研究内容:
本研究以水稻为主要研究材料,对经EMS诱变处理的F2代水稻进行外显子组测序,有效鉴定出EMS诱变样本中的基因突变,并对这些突变造成的基因功
能的影响进行了评估。此外,还对EMS诱变的四倍体小麦进行了外显子捕获及突变分析,阐明了该技术同样也适用于多倍体的研究。

EMS诱变水稻样本的制备与分析流程

EMS诱变水稻样本的制备与分析流程

研究结果:

● 1. 水稻采用罗氏 Nimblegen平台,捕获区域为39 Mb。

● 2. 对EMS诱变的M2代水稻进行外显子捕获测序,后续分析发现EMS处理导致约18000个位点突变。

● 3. 对突变位点进行功能分析及统计,73%的突变位点位于基因区域:其中53%在外显子上,20%在内含子上。

● 4. 除基因突变外,EMS诱变还导致大片段的结构变异。

● 5. 外显子捕获及对EMS诱变导致的基因突变的分析同样也适用于多倍体物种。



案例二:全外显子捕获测序有效鉴定由EMS诱发的突变

研究背景:

白皮松是亚高山环境中的关键物种,极易受到各种自然条件及人为因素的影响,保护物种的基因多样性变得至关重要,其中衡量遗传图谱最为关键的是可靠的、可遗传的、高度可变的遗传标记。白皮松的基因组约27Gb,通过对目标基因进行靶向捕获测序用以评估遗传多样性有很大的应用价值。

研究内容:

本研究针对白皮松的7849个基因设计探针进行捕获测序,建立了遗传多样性与地理分布的相关性,为保护白皮松的基因多样性提供有效的数据支持。实验结果同时也表明,针对基因组较大的物种进行目标基因靶向捕获是十分高效的研究方法。


白皮松样本区域分布

白皮松样本区域分布

研究结果:

● 1. 针对7849个基因设计探针,对来源于48个不同区域的白皮松进行靶向捕获测序,共计数据约391 M reads。测序策略为Hiseq2000,PE100。


● 2. 基于测序数据及PCA分析,建立白皮松的遗传多样性与地理分区的相关性,为种质资源保护提供有力的数据支持。


案例三:玉米重组自交基因组结构变化研究

本研究通过对两个玉米重组自交系与亲本参考基因的分析揭示了数百个de novo拷贝数变异( CNVs),这些基因组结构变化分别通过PCR和全外显子捕获测序进行了验证。本研究选取了185个基因组区域,约覆盖了38个高可信度的基因,结果在两个重组自交系中发现了明显的de novo拷贝数变异。在许多实例中,相同的拷贝数变异现象在多个重组自交系中均有观察到。进一步分析表明,这些CNVs的产生源于亲本基因中位于非等位基因位置的单拷贝同源序列发生的越亲隔离现象。

捕获测序案例:玉米重组自交基因组结构变化研究-欧易生物


案例四:大麦全外显子捕获研究

本研究将高达5G的大麦全基因组序列通过筛选,压缩到了约61.6M大小,共包含155863个外显子、35297个cDNA、108759个转录本重叠群,大大减少了不必要的测序量,加大了测序深度。通过NimbleGen捕获测序平台,对多个大麦物种外显子组进行了高特异性捕获,并进行了后续变异分析。研究表明,捕获测序相对于全基因组测序能够更广泛更有深度地针对编码区变异状况进行检测,能够更有效地使用软件进行后续分析。

捕获测序案例:大麦全外显子捕获研究-欧易生物


参考文献

[1]Henry IM, Nagalakshmi U, Lieber man MC, et al. Efficient Genome-Wide Detection and Cataloging o f EMS-Induced?Mutations Using Ex ome Capture and Next -Generation Sequencing. Plant Cell. 26, 1382-1397 (2014).(IF: 8.538)
[2]Syring JV, Tennessen JA, Jennings TN, et al. Targeted Capture Sequencing?in Whitebark Pine Reveals Range-Wide Demographic and Adaptive Patterns?Despite Challenges of a Large, Repetitive Genome. Front Plant Sci. 7, 484?(2016). (IF: 3.948)?37 38

[3] Liu S, Ying K, Yeh C, et al. Changes in genome content generated via segregation of non-allelic homologs. The Plant Journal. 2012; 72(3): 390-399.?

[4] Martin M, Richmond TA, Gerhardt D, et al. Barley whole exome capture: a tool for genomic research in the genus Hordeum and beyond. The Plant Journal. 2013; 76(3): 494-505.