行业讯息

Nature Medicine | 单细胞核技术揭示单细胞转录组细胞类型偏差

研究背景

肿瘤微环境是由恶性细胞和非恶性细胞构成的复杂细胞生态环境,其多样性和细胞间相互作用与癌症进展,药物反应和耐药性息息相关。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术为我们提供了肿瘤研究的新兴手段,通过单细胞基因组学分析可揭示肿瘤复杂生态系统中细胞类型、状态、遗传多样性以及相互作用。利用 scRNA-seq 探索肿瘤微环境并绘制肿瘤细胞图谱是当下的研究热点,然而随着越来越多的癌症研究尝试使用 scRNA-seq,其技术上的局限性也暴露无遗。

使用 scRNA-seq 对临床肿瘤样本进行研究所面临的挑战:首先,解离和转录偏好性,即在肿瘤组织解离过程中,酶消化可能会导致敏感细胞丢失或基因表达的改变,从而影响结果可靠性。其次,单细胞测序对细胞活性要求极高,需要对新鲜组织进行快速解离,因此要求组织采集和处理团队之间的紧密协调,这给临床实验带来了不小的挑战。而单细胞核测序(snRNA-seq)技术的产生不仅允许我们对冻存组织进行测序,还可以处理新鲜的难解离样本,并有效避免解离和转录偏好,突破了原有 scRNA-seq 的技术局限性。但是,与单细胞相比,单细胞核的 mRNA 含量较低,因此难以富集感兴趣的特定细胞类型。

由此可见,scRNA-seq 和 snRNA-seq 各有优劣,针对不同肿瘤中细胞成分和细胞外基质的不同,两种技术在运用时应根据肿瘤类型,样品特性以及研究问题等进行相应的改进,这给实际实验操作带来了挑战。
 

研究目的

针对以上挑战,来自 MIT 的 Aviv Regev 和 Orit Rozenblatt-Rosen 团队合作在Nature Medicine上发表了题为 A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors 的文章,开发出分别用于处理新鲜肿瘤组织和冷冻肿瘤组织的 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的系统化工具包,其中包含了实验流程和方法、计算过程和评估指标。作者旨在根据不同肿瘤类型开发一套优化的实验流程指南,有助于研究人员从系统工具包中定制最适合其研究目标的实验方案,并指导如何为新的肿瘤和样本类型定制方案。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

 

研究思路

为了研发根据肿瘤类型定制化的sc/snRNA-seq工具包,研究人员对8种具有不同组织特征的23个肿瘤样本进行测试,分析了40个样品中216490个细胞及细胞核信息。肿瘤类型包括:非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性乳腺癌(MBC)、卵巢癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤(GBM)、儿童高级胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、儿童肉瘤和黑色素瘤。

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Figure 1: 工具箱流程图
 

作者首先对不同肿瘤类型的新鲜/冷冻样本进行 scRNA-seq 和 snRNA-seq, 测试不同的实验方法,以及来自同一肿瘤样本的新鲜和冷冻状态的比较,并根据细胞/核质量、数据恢复的细胞数与预期的细胞/核数量、细胞组成等指标对测序结果进行评估。接着,作者将 scRNA-seq 和 snRNA-seq 针对同一肿瘤类型的结果进行对比分析。与此同时,作者还开发了使用积云(Cumulus,一种基于云的数据分析框架)进行初始数据质控分析,有助于指导研究人员根据肿瘤和样本类型定制最佳的实验方案。
 

研究结果

· scRNA-seq实验流程优化 ·


1) 组织解离流程优化

作者针对五种类型的新鲜肿瘤(NSCLC,卵巢癌,MBC,神经母细胞瘤,GBM和冷冻保存的CLL)定制了优化的实验流程,用于scRNA-Seq的标本采集和解离。该实验流程将临床组织样本获得和样本解离的时间间隔最小化,以大程度地提高细胞活性和RNA的完整性。

为了测试最有效的解离方法,作者将大的肿瘤标本分成小的碎片(〜0.5–2 cm),并采用不同的方案进行解离。作者根据每种肿瘤类型的具体特征,如细胞类型组成和细胞外基质成分,并结合文献报道和处理类似人或小鼠组织的经验,选择最优化的酶混合物对新鲜组织进行处理。

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Figure 2: scRNA-seq流程图
 

例如使用Liberase TM分解乳腺癌的胶原纤维,使用木瓜蛋白酶分解GMB的细胞外基质,同时使用DNA酶I消化死亡细胞释放的DNA,降低分离混合物的粘度。而肿瘤组织处理过程的优化方案中需要考虑对测序结果的细胞类型特异性和细胞组成等质控指标的影响。

例如,NSCLC组织样本可使用3种消化方案:

1)胶原酶4 (NSCLC-C4);

2)PDEC酶混合物(pronase、dispase、elastase和collagenases A/4);

3)LE酶混合物(Liberase TM和elastase),分别与DNase I结合使用。

所有方法都检测到相似的具有高质量表达谱和拷贝数变异(Copy Number Aberration,CNA)的恶性细胞数,以及双重液滴数,但只有PDEC和LE方法检测到成纤维细胞和内皮细胞。以回收细胞数和RNA“空液滴”作为质控(QC)的评估标准,作者最终选择了PDEC方法来处理NSCLC肿瘤样本,因为它平衡了细胞类型的多样性和每种细胞类型的QC。

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Figure 3: 不同肿瘤组织解离方法对比
 

2)CD45+免疫细胞去除

由于在某些肿瘤样本中恶性细胞比例较低,免疫细胞比例特别高,为了有效富集样本中的恶性细胞,作者考虑采取去除CD45 +免疫细胞的策略,既可以富集没有特异性标记的上皮细胞,又可以维持任何基质细胞。作者选择将MACS MicroBeads与抗CD45抗体一起使用,并通过测试不同的商业试剂盒找到了最适合回收的试剂盒。NSCLC肿瘤在免疫细胞清除前后,scRNA-seq中恢复的上皮细胞比例分别为26%和82%。此外,研究人员证实scRNA-seq工具包可用于不同解剖部位的临床活检样本和治疗后样本。

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Figure 4: 去除免疫细胞前后细胞比例
 

· snRNA-seq实验流程优化 ·


对于实体瘤冷冻样本,作者选择采用snRNA-seq,并对比评估了4种核分离方法在多种肿瘤冷冻样本中的应用:

1)EZPrep;

2)NST(Nonidet P40、盐和Tris);

3)CST(CHAPS、盐和TRIS);

4)TST(吐温、盐和Tris)。

经过对比发现,TST、CST、NST三种方法分离的核质量类似,但TST方法产生的细胞类型多样性大、每种细胞的核数目最多、线粒体基因表达最高,NST产生的细胞核中基因最少、细胞类型多样性最低。

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Figure 5: 肿瘤冷冻样本snRNA-seq处理方案选择
 

· scRNA-seq和snRNA-seq对比 ·


最后,作者通过在神经母细胞瘤,MBC,CLL中测试来自同一标本的匹配样品来比较scRNA-Seq和snRNA-Seq。两种方法检测到的细胞类型类似,但比例存在差异。

例如,在神经母细胞瘤和MBC中,免疫细胞在scRNA-Seq中比例更高,而snRNA-Seq实质性细胞(特别是恶性细胞)比例更高。在所有被测试的肿瘤类型中,细胞和细胞核测序结果可通过典型相关性分析和细胞类型分组进行批量校正。

作者将scRNA-seq和snRNA-seq记录的新鲜组织细胞和冷冻组织细胞核中表达模型进行对比分析,探究组织消化过程对细胞/细胞核的影响。

研究发现,解离信号在scRNA-seq中的检出率远高于snRNA-seq,尤其是在免疫细胞如T、NK、巨噬细胞等和基质细胞如成纤维细胞和内皮细胞中更为突出,这有可能是实质细胞解离损伤释放的信号所致,也有可能是免疫激活和早期反应的信号。

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Figure 6: 同种样本scRNA-seq和snRNA-seq比较

总而言之,该研究进一步开发并完善了scRNA-seq和snRNA-seq在肿瘤组织中应用的工具包,为多种类型肿瘤研究提供指导,同时提供从工具包中为其他类型的肿瘤选择测试和方法的标准,为绘制肿瘤图谱提供资源。
 

编者按

临床样本的快速采集和即时处理一直是单细胞测序实施方面的一大难题,针对不同肿瘤类型的新鲜和冷冻组织的消化和解离也还尚没有定制的实验流程。在此,作者通过开发用于scRNA-seq和snRNA-seq的系统工具箱来应对这些挑战,并提供从样品采集到文库制备的详细工作流程和协议,以处理八种肿瘤类型的新鲜和冷冻临床肿瘤样品,以及用于处理未来临床肿瘤样品的测试和选择方案的指南。

作者的工具箱将帮助研究人员系统地分析人类肿瘤,为多种类型肿瘤研究提供指导,从而加深对肿瘤生物学的了解,同时提供从工具包中为其他类型的肿瘤选择测试和方法的标准,为绘制高分辨率肿瘤图谱提供资源,有助于提高未来诊断和治疗的准确性。

END 
 

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