项目文章

Plant Physiol:隐花色素在光周期开花调控中的作用机制

前言

2020 年 7 月,上海师范大学杨洪全教授为通讯作者,在 Plant Physiology 杂志(IF: 6.902)在线发表了题为“Photoexcited Cryptochrome 2 Interacts Directly with TOE1 and TOE2 in Flowering Regulation”的研究论文,深入解析了隐花色素 2 在开花调控中的作用机制。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

文章中酵母文库实验由欧易生物完成。

 

研究背景

隐花色素 CRYs 是蓝光受体,参与了动植物中多种光信号的响应。拟南芥中有两个隐花色素 CRY1 和 CRY2,可以介导包括光周期开花启动等许多光反应。CRY2 通过与蛋白泛素化 E3 连接酶 COP1 及其增强子 SPA1 结合,以稳定调控蛋白 CONSTANS (CO) 和促进 FT 基因的转录,并启动开花。转录因子 TOE1 可以通过间接抑制 CO 转录活性、直接与 FT 结合,以实现对 FT基因转录和开花的负调控。但 CRYs 与 TOEs 如何协同作用以实现对开花过程的调控?
 

研究内容

本研究证明 CRY1 和 CRY2 在开花调节中以蓝光依赖的方式与 TOE1 和 TOE2 发生直接结合。遗传研究表明,TOE1 和 TOE2 突变部分抑制了 cry1 cry2 突变植株的晚花表型。蓝光触发的 CRY2 与 TOE1 和 TOE2 的相互作用促进了 TOE1 和 TOE2 与 CO 的解离,从而减轻了它们对 CO 转录活性的抑制并增强了 FT 转录。本研究还表明 CRY2 抑制了 TOE1 与 FT 增强子内调控元件的结合。这些结果揭示了 TOE1 和 TOE2 作为 CRY2 的下游组分,通过调节 CO 活性和 FT转录部分介导了 CRY2 对光周期开花的调节。
 

研究结果

1. CRY1、CRY2 可以与 TOEs 直接结合

已有研究表明,CRY1 的 N 端结构域(CNT1)能够单独介导下胚轴伸长的蓝光抑制。以 CNT1 为诱饵,通过酵母双杂交进行筛选,结果显示 TOE1 可以与 CNT1 互作。一对一酵母验证实验显示,在黑暗和蓝光条件下,TOE1 都可以与完整的 CRY1 发生互作。同时酵母双杂交实验表明 TOE2 也可以分别与 CNT1、CRY1 互作(下图 A、B)。同样,CNT2、CRY2 也可以与 TOE1、TOE2 发生互作(下图 C)。

同时,分段进行 pull-down 实验表明(下图 D-G),CRY1、CRY2 的 N 端和 C 端都可以分别与 TOE1、TOE2 发生直接结合。同样,对 TOE1、TOE2 分段克隆进行酵母双杂一对一验证,结果表明与 CRY2 的结合依赖于 TOE1、TOE2 的 N 末端结构域。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

图片说明:A) 酵母双杂交筛选显示 CNT1 可以与 TOE1、TOE2 结合;B) C) 不同光照条件下,酵母双杂交验证 CRY1、CRY2 与 TOE1、TOE2 结合;D) – G) pull-down 检测 TOE1、TOE2 与 CRY1、CRY2 不同区段的结合能力
 

2. CRY1、CRY2 可以在植物细胞内与 TOE1、TOE2 结合

在烟草叶片细胞进行荧光定位实验(图 A),结果显示 TOE1、TOE2 与 CRY1 共定位于相同的核体。BiFC 实验、双荧光互补实验(图 B-G)也显示类似的结果,表明 CRY1 可以在植物细胞内与 TOE1、TOE2 结合。

同样采用上述实验手段证实,CRY2 也可以在植物细胞内与 TOE1、TOE2 结合。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

图片说明:A) CRY1 与 TOE1、TOE2 荧光共定位实验;B) – G) 双荧光互补实验检测 TOE1、TOE2 与 CRY1 及其不同区段的相互作用
 

3. CRY1、CRY2 以蓝光依赖的模式与 TOE1、TOE2 结合

为了研究不同光照对 CRY 与 TOE 蛋白结合的影响,semi-in vivo pull-down 实验显示,在蓝光暴露条件下幼苗中 TOE1、TOE2 可以 pull down 下来 CRY1、CRY2,但无法在黑暗、红光或远红光暴露的幼苗中 pull down(下图 A-D)。

将过表达 TOE 的 mTOE1-Flag、mTOE1-Flag 分别与过表达 CRY 的 Myc-CRY1-OX、Myc-CRY2-OX 的拟南芥杂交,在双转基因系(Myc-CRY1-OX/mTOE1-Flag、Myc-CRY2-OX/mTOE1-Flag、Myc-CRY1-OX/mTOE2-Flag、Myc-CRY2-OX/mTOE2-Flag)中进行 Co-IP。结果显示,在蓝光条件下培养的拟南芥中,利用 Myc-CRY1、Myc-CRY2 可以 IP 到 TOE1-Flag、TOE2-Flag(下图 E-H)。以上结果表明 CRY1、CRY2 以蓝光依赖的模式在植物体内与 TOE1、TOE2 结合。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

图片说明:A) – D) semi-in vivo pull-down 检测不同光照条件下 CRY1、CRY2 与 TOE1、TOE2 的结合;E) – H) Co-IP 检测不同光照条件下 CRY1、CRY2 与 TOE1、TOE2 的结合
 

4. 长日照下 TOE1、TOE2 作为 CRY1、CRY2 的下游参与开花时间调控

长日照条件下,与 cry1 cry2 双突变体相比,toe1 toe2 cry1 cry2 四突变体开花时间明显更早,但又显著晚于 toe1 toe2 双突变体(下图 A-C)。相应地,RT-PCR 也显示 FT 基因表达量在四突变体中高于 cry1 cry2 双突变体,但低于 toe1 toe2 双突变体;CO 表达量变化不明显。在 cry1 cry2 双突变体中转入 mTOE1-Flag、mTOE2-Flag,会导致开花时间进一步延迟(下图 D-J)。以上结果表明,TOE1、TOE2 作为 CRY1、CRY2 的下游参与对开花时间的调控。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

图片说明:A) -F) 双突变体和四突变体开花时间统计;G) H) WB 检测 TOE1、TOE2 蛋白表达水平;I) J) 在野生型和双突变体中过表达 TOE1、TOE2 对开花表型影响


5. CRY2 促进了 TOE1、TOE2 与 CO 的分离

TOEs 主要作用是与转录因子 CO 结合以抑制其转录激活活性。Pull-down 实验显示(下图 A、B),TOE1 可以与 CO 结合,而 CRY2 的存在可以减弱 TOE1 与 CO 的结合。同时,与黑暗条件相比,蓝光暴露的 CRY2 过表达幼苗中 TOE1 与 CO 的结合减弱(下图 C)。双荧光互补实验、co-IP 实验也显示,在 CRY2 存在的条件下,TOE1 与 CO 的结合受到了抑制。semi-in vivo pull-down 实验显示(下图 K、L),与黑暗培养幼苗相比,在蓝光暴露条件下幼苗中 TOE1 可以 pull down 下来 CO 更少,但 cry1 cry2 双突变体中 CO 蛋白的量不受影响。以上结果表明,蓝光条件下 CRY2 与 TOE1 的结合导致 TOE1 与 CO 的结合减弱。

同时,双荧光报告实验证实,共表达 TOE1/TOE2 和 CO,FT 表达受到明显抑制;而同时再共表达 CRY2 后,FT 表达的抑制现象明显减轻。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

图片说明:A) – C) pull down 检测 CO 与 TOE1 的结合;D) – I) 双荧光互补实验检测 CO 与 TOE1 的结合;J) Co-IP 检测 CO 与 TOE1 的结合;K) – L) semi-in vivo pull-down 检测 CO 与 TOE1 的结合。
 

6. CRY2 抑制了 TOE1 结合到 FT 3’端调控区

已知 TOE1 通过结合到 FT 基因的启动子区域和 3’端调控区以调控 FT 的转录。ChIP PCR 显示(下图 A、B),与野生型相比,cry1 cry2 双突变体中 TOE1 显著富集结合到 FT 基因的区域 R,暗示 CRY2 可能抑制了 TOE1 和 FT 3’ 端的结合。

EMSA 实验显示,FT 基因上的 TBS-like motif CCTCGAC 对于 TOE1 的结合是必需的,而在 CRY2 存在下 TOE1 与该 motif 的结合减弱(下图 D)。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

 

研究结论

本研究揭示了一个光周期开花调控的新模式:在长日照条件下,CRY2 表达激活,CRY2 以蓝光依赖的模式与 TOE 结合,抑制了 TOE 与 CO 的结合、以及 TOE 对 FT 转录的激活作用,最终实现对植物的光周期开花调控。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序


参考文献

Shasha Du, Ling Li, Li Li, et al. Photoexcited Cryptochrome 2 Interacts Directly with TOE1 and TOE2 in Flowering Regulation. Plant Physiol 2020; doi: 10.1104/pp.20.00486.

 

上一篇:“混双羽毛球” ——欧易集团8月“Sunshine”活动第二弹下一篇:Adv Sci:干细胞治疗阿尔兹海默症的分子机理