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项目文章 | PC:水稻 RDR6 在减数分裂DNA双链断裂形成中的作用机制

前言

2020年10月,中国科学院遗传与发育生物学研究所程祝宽研究员、南京农业大学吴玉峰教授为共同通讯作者,在Plant Cell杂志(IF=9.618)发表题为“Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6 Contributes to Double-Strand Break Formation in Meiosis”的研究论文,该研究对OsRDR6(Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6)参与水稻减数分裂DSB(双链断裂,Double-strand Break)形成的分子机制做了深入探索。博士研究生刘长振、助理研究员沈懿、以及已毕业的覃宝祥博士为论文的共同第一作者。文章中 RNA-seq、small RNA 测序、WGBS 由欧易生物提供服务。

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据悉,程祝宽研究员长期从事水稻减数分裂方面的研究,在该领域取得一系列原创性科研成果,国际上享有盛名;而作为青年一代的吴玉峰教授,回国以后在计算生物学领域已发表多篇具有影响力的科研论文。

 

研究背景

由于在抗病毒防御中的作用,植物RNA依赖性的RNA聚合酶(RDR)被广泛研究,RDRs的作用与相关的DICER类蛋白和AGO(Argonaute)蛋白功能密切相关。RDR6是RDR家族中的一个重要成员,其在small RNA介导的基因沉默过程中发挥着极其重要的功能。已有的研究表明RDR6在PhasiRNA (Phased small interfering RNA) 以及TasiRNA (Trans-acting small interfering RNA)的合成过程中发挥作用,并因此参与到抗病以及器官发育等多个过程。然而,目前对OsRDR6在减数分裂中的作用机制仍不清楚。

 

研究内容

本文基于一个可引起减数分裂特异表型的 OsRDR6 新等位突变体Osrdr6-meiosis (Osrdr6-mei ) 展开一系列研究,解释了RDR6参与减数分裂过程中DSB形成的基本机制。作者首先将 OsRDR6 的野生型基因组序列导入纯合Osrdr6-mei 突变体中,在遗传上证实突变体的不育是由 OsRDR6 基因突变所引起。进而通过基因敲除(CRISPR-CAS9)以及等位杂交实验构建了双等位突变体Osrdr6-bi,发现OsRDR6对于减数分裂DSB形成是必不可少的。Osrdr6-mei 中small RNA的表达变化表明,水稻减数分裂过程中small RNA的合成调控依赖于RDR6。此外,WGBS分析还发现OsRDR6对small RNA的调节作用显著影响全基因组DNA甲基化水平。在 Osrdr6-mei 中,small RNA表达差异导致与DSB形成相关的三个基因下调,这可能就是突变体中减数分裂DSB形成异常的原因。

 

研究路线

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研究结果

1. 水稻不育突变系特性研究

首先,采用籼稻品种中籼3037获得不育突变株,其表现出正常的营养生长,却完全不育。自交杂合植株后代中可育株与不育株的分离比例为3:1,表明不育表型受1对隐性核基因控制。进一步将目的基因定位在1号染色体的长臂上,发现1个候选基因编码水稻中的RDR6蛋白,故将该突变体命名为 Osrdr6-mei。

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图1 Osrdr6-mei 表型分析

 

2. 水稻DSB形成需要OsRDR6

通过染色体行为分析和荧光原位杂交(FISH)实验确认Osrdr6-mei 花粉母细胞中的部分同源染色体在粗线期不能配对,在终变期可明显检测到单价体(不能配对的同源染色体)。进一步通过对花药进行半薄切片实验发现Osrdr6-mei 的花粉母细胞在减数分裂后期逐渐开始解体,表明减数分裂细胞可能已经凋亡。采用特异性识别磷酸化形式的水稻组蛋白γH2AX抗体进行免疫荧光染色来监测DSB形成,结果表明突变体中DSB的数目显著减少。

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图2 Osrdr6-mei的细胞学分析

 

为进一步证实OsRDR6在减数分裂DSB形成中的作用,作者进一步构建了Oscom1 Osrdr6-mei 双突变体。当 OsCOM1 功能丧失会导致非同源染色体粘连(这类非同源染色体的粘连是由于DSB修复异常所致,故粘连的发生依赖于DSB的形成),而在双突变体中,异常染色体粘连的现象受到部分抑制。该结果在遗传上证实 Osrdr6-mei 中形成的DSB较少。

 

3. 双等位突变体Osrdr6-bi分析证实OsRDR6是DSB形成所必需

利用CRISPR-CAS9系统及等位杂交技术创建的双等位突变体Osrdr6-bi,其不育表型与生长状态同 Osrdr6-mei 类似。Osrdr6-bi 中,在减数分裂粗线期没有观察到同源染色体配对,且超过90%的减数分裂过程均受阻。

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图3 Osrdr6-bi 的遗传构建和细胞学分析

 

由于ZEP1是水稻联会复合体(Synaptonemal Complex, SC)的重要成分,对其进行免疫荧光染色发现:在 Osrdr6-bi 中ZEP1信号呈点状分布,表明 Osrdr6-bi 中SC的形成不正常。且在 Osrdr6-bi 中没有观察到明显的γH2AX信号,表明DSB的形成被完全阻断。11号染色体全长FISH以及DSB修复相关的其它蛋白免疫荧光染色实验也证实OsRDR6对于减数分裂DSB的形成是必需的。

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图4 野生型和 Osrdr6-bi 减数分裂细胞的FISH和免疫荧光染色分析

 

4. Osrdr6-mei 突变体对small RNA生物合成的影响

细线期花药small RNA测序结果显示,small RNA的长度在21-nt有一个主峰,在24-nt处有一个较小的峰。在 Osrdr6-mei 中,21-nt small RNA数量显著低于野生型,而24-nt small RNA数量显著高于野生型。进一步的分析表明,在 Osrdr6-mei 中表现出最显著丰度降低的21-nt small RNA主要来自于基因组中的 phased 位点和未注释区域,而在 Osrdr6-mei 中丰度显著上调的24-nt small RNA来自基因座、重复相关区域和未注释区域。

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图5 来自small RNA测序的大小分布、注释和空间分布

 

通过分析位于基因和转座元件(TE)位点附近的small RNA发现,与野生型相比, Osrdr6-mei 有更少的21-nt small RNA,却有更多的24-nt small RNA,推测OsRDR6调控减数分裂花药中的small RNA表达。

 

5. Osrdr6-mei 的DNA甲基化提升

对野生型和 Osrdr6-mei 花药进行WGBS,结果显示,在 Osrdr6-mei 中的非TE基因上下游1kb和TE附近区域CHH甲基化水平要高得多,而且在 Osrdr6-mei 中发现了更多的CHH高DMR,揭示OsRDR6可能在DNA甲基化中起负作用。

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图6 DNA甲基化与small RNA之间的关系

 

在 Osrdr6-mei 中,CHH 高DMR对应的24-nt small RNA和21-nt small RNA的丰度明显更高;在CHH低DMR对应的24-nt small RNA的丰度同样更高,这意味着24-nt small RNA与DNA甲基化之间存在较为复杂的关系。

 

6. Osrdr6 突变体中 CRC1、P31comet 和 OsSDS 的表达水平降低

转录组测序共鉴定出778个差异表达基因,其中321个基因上调,457个基因下调。有422个(54%)与差异表达的24-nt small RNA有关。这些结果提示与 OsRDR6 相关的small RNA可能对基因表达有普遍性地影响。

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图7 在 Osrdr6 突变体中,CRC1、P31comet 和 OsSDS 下调表达

重点基因 CRC1、P31comet 和 OsSDS 是水稻减数分裂DSB形成所必需的,这些基因都是显著下调的,荧光定量PCR结果也证实相同的变化趋势。通过免疫荧光染色实验发现,CRC1 和 P31comet 蛋白在 Osrdr6-bi 的花粉母细胞染色体中未检测到信号,推测 OsRDR6 可能通过调节水稻中 CRC1、P31comet 和 OsSDS 的表达水平来调控减数分裂DSB的形成。
 

7. Osrdr6-mei 上下调基因受不同途径调控

通过联合分析观察DEG周围small RNA丰度变化,推测在 Osrdr6-mei 中,启动子和3’调控区24-nt small RNA表达的增加可能与基因沉默(下调)有关,而相关基因的上调可能是21-nt和24-nt small RNA表达差异的综合结果。

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图8 small RNA和基因表达之间的关系

 

由于植物中small RNA结合到AGO蛋白是由其5’末端核苷酸类别所介导,而映射到相关基因启动子和3’调控区上的24-nt small RNA的5’末端核苷酸都偏向腺嘌呤,表明这些small RNA中的大多数可结合到AGO2或AGO4蛋白上。

 

从small RNA在上调基因周围区域的分布来看,其调控机制比下调基因更为复杂。DMRs结果中相关的差异基因不包括CRC1、P31comet 和 OsSDS,这表明这些与减数分裂相关的基因表达水平改变,不是直接由small RNA介导的DNA甲基化水平改变所致,这其中的具体作用机制还有待继续深入研究。

 

研究结论

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本文为OsRDR6在调节减数分裂DSB形成提出了一个潜在模型。在野生型中,OsRDR6与其他small RNA合成蛋白共同合作,以维持绒毡层细胞和减数分裂细胞中small RNA表达的平衡。在 Osrdr6-mei 中,OsRDR6功能异常导致24-nt small RNA表达升高,特别是在下调基因的启动子和3’调控区,并因此导致这些基因的表达水平降低。此外,这些24-nt small RNA更有可能与AGO2/4蛋白相结合并组装成small RNA介导的沉默复合体来抑制这些基因的表达。

 

编者按

本文克隆了一个新的水稻 RDR6 突变体,Osrdr6-mei ;并解析了其在减数分裂过程中特异产生表型的分子机制。文中,作者首先确认不育性状是由OsRDR6突变引起,其次利用small RNA测序、WGBS和RNA-seq技术,揭示了OsRDR6对于调节减数分裂时期花药中small RNA平衡是重要的。在突变体中,与DSB形成相关的三个基因下调可能是导致突变体存在DSB形成异常表型的原因。这篇文章系统阐述了OsRDR6对于减数分裂DSB形成的重要作用机制,并突出多组学联合分析之间互作关系,十分值得借鉴。

 

参考文献

Liu CZ, Shen Y, Qin BX, et al. Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6 Contributes to Double-Strand Break Formation in Meiosis[J]. Plant Cell, 2020, 32: 3273-3289.

 

END
 

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