项目文章

欧易单细胞助力解析睾丸生精微环境的正常发育与病理变化

前言

2020年11月10日,上海交通大学附属第一人民医院李铮教授和上海科技大学生命科学与技术学院周智研究员,于Nature Communications(IF: 12.121)在线发表了睾丸生精微环境单细胞测序的新研究成果,研究工作内容的主要承担者为赵亮宇博士。

该研究对10例不同年龄精子发生正常的睾丸样本和7例NOA(非梗阻性无精症)睾丸样本进行了高通量单细胞测序,绘制了人类睾丸生精微环境体细胞的成熟路径图谱,发现了特发性NOA患者睾丸支持细胞具有谱系发育退化的特点。进一步的信号通路分析发现,Wnt通路的下调在支持细胞的成熟过程中具有重要意义,体外抑制特发性NOA患者支持细胞中活跃的Wnt信号可促进其功能成熟。该研究建立了人睾丸生精微环境生理发育与病理变化的单细胞转录数据库,为揭示NOA的发病机理和开发相关治疗靶点提供了新的理论基础与实验依据。

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欧易生物提供了该项目的10x Genomics单细胞转录组测序实验工作。下面,我们一起了解一下这篇文章的研究内容。
 

研究背景

目前世界上患有不孕症的夫妇约占15%。相对于女性不育,由于目前对于精子发生障碍的研究不够充分,导致其相关男性不育治疗难度巨大。NOA(非梗阻性无精症)患者约占不育男性的10-15%,是男性不育中严重的一种,其中70%为特发性NOA(即排除了目前所有已知的先天异常与后天损伤因素导致的精子发生障碍)。该类疾病严重损害了男性健康与家庭社会和谐,探究其发病原因是突破目前临床治疗瓶颈的关键。

 

以往技术手段的不足妨碍了研究人员对生精障碍发病机制的理解。随着单细胞RNA测序的快速发展,使研究人员能够以高分辨率研究睾丸中的不同细胞群。本研究对生精微环境的成熟和潜在发病机制提供了深入的见解,从而为NOA的治疗提供了新的靶点。
 

基本信息

文章标题:Single-cell analysis of developing and azoospermia human testicles reveals central role of Sertoli cells

影响因子:12.121

发表时间:2020年11月

研究材料:10例不同年龄生精正常睾丸样本和7例不同病理类型非梗阻性无精子症睾丸样本

研究方法:高通量单细胞转录组测序(10x Genomics单细胞转录组测序由欧易生物提供技术支持)

 

研究结果

1. 生精正常患者和NOA患者睾丸中多个细胞群概览

作者从10名生精正常患者(2-31周岁,来自于良性睾丸肿瘤等手术捐献组织)和7名NOA患者(3例克氏综合征、1例Y染色体微缺失和3例特发性NOA,来自显微取精手术剩余组织)共获取到88723个睾丸细胞,每个细胞平均检测到2719个基因。UMAP分析显示,不同年龄组的异质性明显,但5个生精正常患者样本的重复性良好(图1b)。进一步,作者在10个生精正常患者的所有细胞中,鉴定出9个细胞群,可分为生殖细胞和微环境体细胞两部分(图1c)。对10个生精正常患者供体分别与Y染色体微缺失、克氏综合征和特发性NOA患者的睾丸体细胞重新聚类,并进行相似性分析显示,正常成人和3种NOA患者之间的支持细胞的转录状态发生了显著的改变(图1d-g)。

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图1 用单细胞RNA-seq分析人类睾丸细胞从婴儿期到成年期和NOA患者的整体表达谱

2. 人类支持细胞在成熟过程中的三个阶段和异质性的鉴定

为了探究睾丸支持细胞在正常发育过程中的发育路径,作者对10个生精正常患者的支持细胞进行再聚类和拟时序分析,并鉴定到3个连续且独立的发育阶段,更新了原来认为支持细胞只有成熟和不成熟两种状态的认知(图2a,b)。结合各样本年龄分析发现,支持细胞在幼龄时便开始逐步向成熟期发育,并在青春期后期达到稳定状态(图2c)。进一步分析各阶段基因表达模式的动态变化,作者筛选出了各个阶段的特征表达基因,并通过免疫组化在蛋白表达层面进行验证(图2d-f)。后续的细胞功能分析阐述了支持细胞在发育过程中增殖、能量代谢、结构重塑和信号分泌等各方面的动态变化,这些变化与生殖细胞在精子发生各阶段的需求紧密相关,进一步说明了支持细胞在生精微环境中的重要作用。

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图2 支持细胞发育的三个成熟阶段的鉴定

3. 支持细胞成熟过程中的调控通路

372个候选调控子的拟时序轨迹的分支节点上显示出显著变化(图3a)。对其进行GO分析,表明类固醇激素是主要的上游细胞外调节信号之一(图3b,c)。IPA分析结果提示,睾丸支持细胞增殖主要发生于第一阶段,而结构重塑开始于第二阶段(图3d,e)。作者通过分析1665个人类转录因子的调控网络和其下游基因集发现,FOSB,EGR3,KLF10等在第一阶段扮演重要角色,而第二和第三阶段的主要调控因子分别为HMGB1,SUB1,CNBP MEF2C,ZFP36L2,NFIX和RORA,SMARCA1,HOPX(图3f-k)。

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图3 推测睾丸支持细胞3个阶段的信号通路和关键调控子

4. 生精微环境的复杂动态网络

为了研究生精环境中复杂的信号网络及其动态变化,作者对睾丸细胞亚群进行了配体-受体分析,发现不同时期内支持细胞与其他细胞亚群均存在大量的相互作用,且这些互作关系随着睾丸发育不断发生改变。该结果首次绘制了人类生精微环境成熟过程中复杂的旁分泌调节网络图谱(图4a-h)。

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图4 睾丸支持细胞与其他细胞相互作用的动态变化

5. 不同类型NOA支持细胞具有不同的病理特征

为了研究病理状态下的微环境变化,作者结合上述正常发育路径与3种NOA样本进行分析。结果表明3类NOA患者支持细胞的转录特征与正常成年人均有显著差异,其中,特发性NOA支持细胞与正常幼稚型支持细胞十分相似,表现为生理性不成熟的特点;而另外两类NOA支持细胞则表现为以异常炎症反应和激素紊乱为特点的病理状态。此外,一些重要的调控子也显示在NOA和正常支持细胞之间表达有所不同(图5a-g)。

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图5 三种NOA支持细胞的单细胞转录组分析

6. 特发性NOA支持细胞成熟障碍的通路分析

作者进一步研究了特发性NOA支持细胞成熟的异质性、增殖能力及其调控网络。来自5个生精正常和3个iNOA患者支持细胞的UMAP图显示,这些支持细胞可以进一步聚集成3个亚群(图6a)。拟时序轨迹分析显示,iNOA支持细胞的成熟特征与早期两个发育阶段相似(图6b)。两类样本之间的差异基因和GSEA分析均证实了iNOA睾丸支持细胞的异质性与谱系退化,并提示Wnt信号的持续激活可能是导致其成熟障碍的原因(图6c-h)。

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图6 表达模式的改变显示了iNOA 支持细胞的异质性和成熟缺陷

7. 抑制Wnt通路可部分恢复特发性NOA患者睾丸支持细胞的成熟障碍

根据上述生信分析结果,作者聚焦Wnt通路对支持细胞功能的影响。通过对比三种抑制剂在支持细胞中Wnt通路的抑制作用,作者选用ICG-001(ICG)进行后续研究(图7a-d)。在体外培养的支持细胞中加入ICG处理14天后,作者发现一些支持细胞的成熟特征基因均发生显著变化,包括第一阶段的特异性基因FOSB,EGR3,JUN表达下调,而第三阶段的HOPX,TSC22D1表达上调(图7e-i)。另外,与精原细胞共培养实验结果表明,诱导成熟的支持细胞比阴性对照组能在更长时间段内维持精原细胞的存活,提示其支持、营养生殖细胞功能的改善(图7j-k)。

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图7 抑制Wnt通路可诱导睾丸支持细胞在体外成熟

 

文章总结

作者以发育时间为横轴,阐明了睾丸微环境发育背后的细胞进程。通过定义睾丸微环境的细胞群,作者揭示了不同细胞类型之间的配体-受体互作网络,提供了更全面的概述。作者聚焦于睾丸支持细胞,通过不同年龄人的单细胞转录组,研究了睾丸微环境成熟的潜在过程。

通过系统的比较生精正常和NOA患者的生精微环境,作者发现了特发性NOA支持细胞谱系退化的特点,并且鉴定了Wnt通路作为诱导其成熟的潜在治疗靶点。这些发现为后续进一步阐明睾丸发育过程、探究NOA的发病机制、开发有效干预措施提供了良好的基础。

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图8 本文的主要内容示意图

 

欧易生物单细胞事业部

欧易生物是国内少数具备10x Genomics和BD Rhapsody™单细胞测序双平台的机构之一,在医学和农林方向提供专业的单细胞建库测序及分析服务,包括5’端和3’端基因表达分析、免疫组库分析(TCR/BCR)、 ATAC分析和表面蛋白分析等。

欧易生物单细胞平台具有丰富的项目处理经验,每年成功处理单细胞样本上千例;专业的售后团队,数十位生信专家和研发工程师为您的项目保驾护航;资深的技术支持人员,优化课题设计,解读数据,让客户感受有“温度的”全面服务。

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END
 

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