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PP:欧易水稻转录因子文库助力扬州大学陈忱教授水稻胚乳发育调控研究

前言

2020 年 12 月 11 日,扬州大学陈忱教授为通讯作者,在 Plant Physiology (IF: 6.902) 发表了题为“OsYUC11-mediated auxin biosynthesis is essential for endosperm development of rice”的研究论文,报道了 OsYUC11 介导的植物生长素生物合成在水稻胚乳发育过程中的作用。

 

文章中水稻转录因子文库筛选服务由欧易生物提供。

欧易水稻转录因子文库助力扬州大学陈忱教授水稻胚乳发育调控研究

 

研究背景

生长素是植物发育必不可少的植物激素。吲哚-3-乙酸 (IAA) 是生长素的一种活性内源形式。拟南芥的氨基转移酶 TAA 家族可以将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸 (IPA),IPA 在 YUCCA (YUC) 黄素单加氧酶的催化下生成 IAA。IAA 生物合成的两步反应被称为 TAA-YUC 途径。许多参与生长素合成的基因对植物胚胎发生是不可或缺的,然而,对生长素如何调节胚乳发育仍知之甚少。

 

研究内容

本研究揭示了水稻 YUCCA(YUC) 黄素单加氧酶编码基因 OsYUC11 是水稻胚乳中生长素生物合成的关键因子。OsYUC11 突变阻碍了籽粒灌浆和贮藏产物的积累,施用外源生长素可以回复其缺陷。通过筛选水稻转录因子酵母文库,鉴定出 41 种可能与 OsYUC11 启动子结合的转录因子,其中 OsNF-YB1 主要在胚乳中表达。osyuc11 和 osnf-yb1 突变体的种子变小、垩白增加,同时 IAA 的生物合成减少。OsNF-YB1 可以与 OsYUC11 启动子结合以激活基因表达。

 

研究还发现,OsYUC11 是一个动态印迹基因,在受精后 10 天主要在胚乳中表达父本等位基因,随后在受精后 15 天成为非印迹基因。OsYUC11 的功能性母本等位基因能够回复该基因的父本缺陷。本研究表明 OsYUC11 介导的植物生长素生物合成在水稻胚乳发育过程中起到了重要作用。

 

研究结果

1. 水稻胚乳中偏向性表达一组 YUCs

拟南芥和水稻基因组中分别编码 11 个和 14 个 YUC 基因,系统发生分析显示拟南芥中的 AtYUC10/11 可以和水稻的 OsYUC9/10/11/12/13/14 聚为一枝(图 A)。已有研究表明,AtYUC10/11 参与拟南芥胚胎发生和胚乳发育。水稻中 RT-PCR 显示,OsYUC9/11/12 在颖果中高表达,其中(图 B):OsYUC9 在受精后 5-15 天(5-15 DAF)稳定高表达;OsYUC11 在 5 DAF受精后表达激活,并且在 15 DAF 表达达到峰值;OsYUC12 在 3-5 DAF 短暂激活。

 

在 7 DAF RT-PCR 显示,OsYUC9/11 主要在胚乳中表达,OsYUC12 几乎不表达。利用 OsYUC11 启动子融合 GUS 检测显示,5-6 DAF 可以观察到 GUS 信号(图 C)。原位杂交也表明 OsYUC11 主要在 6 DAF 的胚乳中表达(图 D、E)。

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图片说明:水稻 OsYUC 基因的同源分析和表达模式检测

 

2. OsYUC11 突变导致籽粒灌浆缺陷和胚乳贮藏产物累积

为进一步研究 OsYUC11 对种子发育的影响,利用 CRISPR/Cas9 构建了 osyuc11 突变体。与野生型相比,所有 osyuc11 突变体都没有明显的营养生长缺陷,株高、穗数、结实率等没有明显影响,但突变体的粒重下降到野生型的 60-70%(图 A-C)。osyuc11 突变体颖果干重从 5 DAF开始 显著降低(图 D),突变体 30 DAF的胚乳发育状态和野生型15 DAF类似(图 E)。以上结果表明 OsYUC11 对于水稻灌浆至关重要。

 

大部分成熟的 osyuc11 突变体种子垩白度增加,这主要是由于外周胚乳细胞中的淀粉粒排列相对松散造成的,突变体中央胚乳细胞中淀粉粒的形态和排列和野生型没有明显差别。突变体胚乳中总淀粉含量与野生型相当、总蛋白和总脂质含量高于野生型。定量显示,osyuc11 突变体中积累了更多的醇溶蛋白和谷蛋白。

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图片说明:osyuc11 突变体的表型特征

 

3. osyuc11 突变体颖果中生长素生物合成受阻

使用人工生长素响应元件 DR5 观察生长素内源性分布,结果显示胚乳中生长素在5 DAF后迅速积累,这和OsYUC11在5 DAF被表达激活是一致的(图 A)。在 osyuc11 突变体中,IAA 含量显著降低(图 B),一些负责生长素生物合成和应答的基因表达量也相应地降低(图 C-E)。

 

同时,与对照组相比,对 osyuc11 突变体施用外源生长素 NAA 可以显著提高粒重(恢复至野生型的 91%),垩白也有所减轻(图 F-G)。而施用生长素运输抑制剂 NPA可以进一步降低 osyuc11 突变体和野生型的粒重(图 H-I)。以上表明 OsYUC11 可以通过水稻胚乳中生长素的生物合成来调控籽粒灌浆。

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图片说明:osyuc11 颖果中生长素生物合成减少

 

4. 转录组测序揭示了 osyuc11 颖果中的代谢紊乱

对 10 DAF 的颖果进行转录组测序,富集分析显示 osyuc11 突变体中差异表达的基因主要参与初级代谢、脂质代谢、蛋白质代谢等。内质网应激基因、热休克蛋白基因、转录因子编码基因均存在差异表达。许多生长素响应基因也显著下调。

 

5. OsNF-YB1 调控 OsYUC11 的表达

为了研究 OsYUC11 的转录调控,利用水稻转录因子文库进行了筛选,结果显示有 41 个转录因子可以结合到 OsYUC11 的启动子区域,其中的 OsNF-YB1、OsMAD14 与 OsYUC11 在颖果发育中的表达模式最为相似(图 A)。其中 OsNF-YB1 仅在胚乳中表达,并且与 osyuc11 突变体类似,OsNF-YB1 突变也可以导致籽粒变小和垩白增加(图 B)。OsNF-YB1 主要在糊粉层表达,在中央胚乳中的表达水平和 OsYUC11 相当(图 C)。

 

与野生型相比,ofnf-yb1 突变体 10 DAF 颖果中 IAA 含量降低、多个生长素响应基因表达量下调(图 E-I)。OsNF-YB1 过表达水稻中,OsYUC11 表达量也随之上升。而在 osyuc11 突变体中,OsNF-YB1 表达水平未受明显影响。以上结果表明,OsYUC11 表达可能受到 OsNF-YB1 的调控。进一步的ChIP-PCR实验 证实 OsNF-YB1 可以直接结合到 OsYUC11 启动子以激活其表达。

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图片说明:OsNF-YB1 突变抑制颖果中 OsYUC11 的表达和 IAA 的生物合成

 

6. OsYUC11 是一个水稻胚乳中的动态印迹基因

已有报道显示 OsYUC11 是一个主要在胚乳中表达父本等位基因的印迹基因。为研究 OsYUC11 印迹对胚乳发育的影响,对 WT 野生型和 osyuc11 突变体进行正反杂交实验,结果显示 WT (♀)/osyuc11 (♂) 种子表型与 WT (♀)/WT (♂) 更为相似(图 A-B)。

 

对 WT (♀)/osyuc11 (♂) 的 cDNA 进行测序显示,OsYUC11 在 10 DAF 只特异性表达父本基因、在 15 DAF 开始表达母本基因(图 C)。推测是 OsYUC11 母本基因的表达修复了WT (♀)/osyuc11 (♂) 种子的缺陷表型。

 

PRC2 介导的 H3K27me3 对于基因印迹调节非常重要。OsFIE1 和 OsEMF2a 是 PRC2 的成员。在 osfie1 和 WT 正反交中,OsYUC11 在 10 DAF 表达出现父系偏向性(图 D),表明 OsYUC11 表达偏向性不受 OsFIE1 突变影响。

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图片说明:OsYUC11 的动态印迹

 

7. OsYUC9、OsTAR1 突变对籽粒灌浆的影响相似

同样,ouyuc9 突变体也表现出粒重下降、垩白增加。与 OsYUC11 类似,OsYUC9 表达水平在 osnf-yb1 突变体中下降、在 OsNF-YB1 过表达水稻中上升,表明 OsYUC9 也可能受到 OsNF-YB1 调控。而 Osyuc12 突变体表型没有明显改变。

 

OsTAR1 和 OsTAR2 催化生长素生物合成的第一步。与野生型相比,ostar1 突变体种子较小、垩白增加,结果表明籽粒灌浆延迟,与 osyuc9 和 osyuc11 相似。总之,这些发现表明生长素在水稻籽粒灌浆中起着重要作用。

 

研究结论

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本研究提出了一个 YUC 介导的生长素生物合成在水稻胚乳发育过程中的模型:转录因子 OsNF-YB1 可以结合到 OsYUC11 启动子调控其表达;OsYUC11 突变会导致水稻籽粒灌浆缺陷和胚乳贮藏产物累积,这一过程主要是通过影响生长素的生物合成来调控的。

 

参考文献

Xu X, E Z, Zhang D, et al. OsYUC11-mediated auxin biosynthesis is essential for endosperm development of rice. Plant Physiology 2020; doi.org/10.1093/plphys/kiaa057.

 

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END
 

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