基本信息

论文题目：Role of C/EBPα hypermethylation in diesel engine exhaust exposure-induced lung inflammation

发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

作者单位：青岛大学医学院青岛市立医院

运用生物技术：MethylRAD甲基化检测技术（该技术由青岛欧易协助完成）

编者按

颗粒物质（Particulate Matter, PM）是全球死亡的第五大风险因素，柴油机尾气（Diesel engine exhausts, DEE）是PM的主要来源之一，其含有多环芳香烃（PAHs），对环境和人体健康有很大的危害。先前的研究表明，炎症、氧化损伤、促凝活性、自主神经系统活性和细胞成分的共价修饰可能是导致暴露于DEE对健康产生不良影响的潜在机制。其中，炎症和氧化损伤是两个最广泛研究的机制。广泛认知氧化损伤是由各种污染物引起，通过细胞凋亡或坏死导致细胞死亡。克拉拉细胞分泌蛋白(CC16)是一种主要由气道远端克拉拉细胞产生的抗炎、抗氧化蛋白，可预防包括慢性阻塞性肺气肿（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）在内的气道炎症性疾病。我们之前的研究发现，抗炎蛋白CC16水平的降低与DEE暴露导致的肺功能损害密切相关。然而，在DEE暴露条件下，抗炎蛋白CC16水平与DNA甲基化的关系尚未见报道。在此，我们旨在研究慢性吸入DEE是否会影响肺功能、CC16表达及DNA甲基化，以及CC16表达与DNA甲基化是否存在密切关系。

技术路线

研究结果

1、DEE暴露对大鼠尿液的影响

HPLC-MS/MS检测结果显示：DEE暴露标志物2-OHPh和9-OHPh、氧化脂质和DNA损伤标记物MDA和8-OHdG，实验组大鼠的水平明显高于对照组。说明暴露于DEE会导致氧化应激。

图1 DEE暴露对大鼠尿液的影响。DEE暴露12周之后收集尿液，用HPLC-MS/MS和ELISA试剂盒检测2-OHPh (A)、 9-OHPh (B)、8-OHdG (C)和MDA (D) 的水平

2、DEE暴露对大鼠血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）的影响

DEE暴露后，血清和支气管肺泡灌洗液中促炎因子IL-8、IL-6和TNF-α的表达量显著上升，抗炎蛋白SP-D和CC16的表达水平显著降低,说明DEE暴露诱导诱导炎症。

图2 DEE暴露对大鼠血清和BALF的影响。用ELISA试剂盒检测催炎因子IL-8、IL-6和TNF-α (A 和 D)和抗炎蛋白（B、E、C、F）的水平

3、DEE暴露对大鼠肺组织的影响

DEE组表现出明显的气道炎症，而且与对照组相比，暴露组中IL-8, IL-6和TNF-α mRNA和蛋白的表达量显著高表达，SP-D和CC16的mRNA 和蛋白有明显低表达。

图3 DEE暴露对大鼠肺组织中IL-8、IL-6、TNF-α、TNF-α和CC16表达量的影响

4、DEE暴露对大鼠肺组织DNA甲基化的影响

用Methyl-RAD进行全基因组甲基化检测，发现对照组和实验组有明显的甲基化差异，其中C/EBPα的启动子区发生了高甲基化，MSP验证分析得到了同样的结果，高甲基化会调控基因的沉默，如预期，DDE组中C/EBPα mRNA和蛋白质的表达量发生了显著的降低。

图4 DEE暴露下大鼠肺组织的DNA甲基化情况。（A）大鼠肺组织的全基因组甲基化测序和热图。（B）DEE暴露引起C/EBPα启动子区一个CG位点的高甲基化。（C）C/EBPα的MSP验证。（D、E）RT-PCR and Western blot检测C/EBPα mRNA和蛋白的表达水平。

5、 柴油机尾气颗粒物（Diesel Exhaust Particles, DEP）暴露条件下，C/EBPα转录因子对CC16蛋白表达的调节

MSP结果显示，DEP暴露诱导C/EBPα启动子的甲基化，DAC（Demethylating Agent 5-aza-2′-Deoxycytidine）通过去甲基化恢复C/EBPα蛋白的表达。DEP暴露降低C/EBPα mRNA和蛋白的表达，CC16的表达水平与C/EBPα一致。这些结果表明，DEP接触，通过C/EBPα启动子的甲基化和C/EBPα转录沉默，导致C/EBPα的低表达，从而抑制CC16的表达。

6、C22细胞中DEP暴露条件下C/EBPα对CC16表达的调节

C22细胞与5 ppm SRM 1650b（柴油颗粒物）共培养72小时（有DAC和无DAC两种条件），MSP检测发现DEP暴露诱导C/EBPα启动子的高甲基化，DAC共处理会通过去甲基化保持C/EBPα的高表达。CC16的表达模式与C/EBPα一致。同时我们检测到DEP处理48小时对C/EBPα的表达影响最大，而且DEP对C/EBPα的影响有浓度依赖性，C22细胞中C/EBPα的敲除会导致CC16表达的显著降低，综上说明DEP暴露会通过C/EBPα启动子的高甲基化和C/EBPα的表达沉默来降低CC16的表达。

图5 C/EBPα 对 CC16表达的调节以及DEP暴露条件下CC16的作用。（A）MSP检测不同条件下C/EBPα启动子的甲基化。（B-E）RT-PCR和Western blot检测C/EBPα和CC16蛋白和mRNA的表达情况。(F)C/EBPα和CC16 mRNA在不同 SRM 1650b 浓度下的表达量情况。(G和H) C/EBPα k敲降对CC16 mRNA和protein表达的影响.。5 ppm SRM 1650b或者1.0 μg/ml rCC16 + 5 ppm SRM 1650b 处理C22细胞72 小时收集细胞上清检测IL-8, IL-6, TNF-α (I) 和SP-D (J) 的表达情况。

文章总结

本研究的目的是研究长时间DEE暴露对肺部炎症的影响和潜在机制的影响。Sprague-Dawley雄性大鼠暴露于3mg/m3的柴油机尾气颗粒（DEP）中12 周，然后收集尿液、血液、支气管肺泡灌洗液和肺部组织，鉴定其生化指标、DNA甲基化状态和组织学变化。结果发现长期暴露于DEE会部分性的通过C/EBPα启动子的高甲基化和C/EBPα的表达沉默来降低CC16的表达，进而诱导肺炎的发生。

参考文献

Wang N, Li QH, Liu H, et al. Role of C/EBPα hypermethylation in diesel engine exhaust exposure-induced lung inflammation. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 183: 109500.

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