前言
 

2020年8月欧易/鹿明生物合作客户孙逸仙纪念医院李建明团队在Microbiome（IF：11.607）发表了题为 “EphB6基因缺陷小鼠的肠道菌群通过介导维生素B6动态平衡调节自闭症样行为”的文章，通过16S rRNA基因测序和LC-MS非靶向代谢组学联合分析等手段，揭示了肠脑微生物群轴对自闭症谱系障碍（ASD）的发展有重大影响，深入而透彻地阐明了肠道菌群影响小鼠脑功能缺陷的新机制。
 

英文标题：EphB6基因缺陷小鼠的肠道菌群通过介导维生素B6动态平衡调节自闭症样行为

研究对象：小鼠粪便、脑组织

发表期刊：Microbiome

影响因子：11.607

单位：孙逸仙纪念医院

发表时间：2020年8月

主要运用欧易/鹿明生物技术：16S rRNA基因测序（欧易生物提供技术服务），LC-MS非靶标代谢组（鹿明生物提供技术服务）
 

研究背景
 

自闭症谱系障碍（ASD）是一种发育障碍性疾病，目前对自闭症的核心症状的有效治疗很有限。ASD患者临床研究证据表明，肠道菌群与ASD发展之间存在联系，但肠道菌群与ASD的脑功能障碍（肠脑轴）联系机制尚未完全阐明。

在肠道稳态起着重要作用的EphB6基因（位于7q号染色体，属于受体酪氨酸激酶Eph家族），因基因突变和在ASD患者中表达下调，被认为是ASD的候选基因。但尚不清楚EphB6在调节肠道菌群和ASD发生的作用机制。

本研究中作者发现EphB6在功能上与ASD相关，并通过肠道菌群介导的维生素B6和多巴胺，调节患者自闭症样行为。作者建立了EphB6基因缺陷小鼠肠道菌群失调与中央前额叶皮层（mPFC）（关键的肠脑功能轴）的兴奋/抑制失衡之间的功能联系。
 

研究思路

实验方法
 

1.实验样本

基于C57BL/6J小鼠系的健康雄性EphB6+/+（WT）和EphB6-/-（KO）小鼠模型。

2.主要实验方法

（1）蛋白和转录分析：蛋白质印记分析、定量逆转录PCR分析；

（2）16S rRNA基因测序分析；

（3）代谢组学实验：LC-MS非靶向代谢组学分析，氨基酸\神经递质LC-MS靶向分析，5-磷酸吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇靶向分析；

（4）其他：组织染色、肠通透性测定、小鼠行为测试、立体定向手术和药物显微注射、脑组织电生理学检测；

实验结果

1.缺失EphB6导致小鼠自闭症样行为和肠道微生物紊乱
 

自闭症样行为增加：作者发现KO小鼠比WT小鼠梳理毛发的时间更多（图1a），且在社交分区测试中社交互动异常。KO小鼠在嗅觉适应性/不适应性测试中对充满社交气味的棉签兴趣较少（图1i），表现出交流障碍。在高架十字迷宫测试中，KO小鼠在开臂处时间更少，而在闭臂时间更长（图1j），表明KO小鼠出现焦虑样行为。总之EphB6的缺失导致小鼠出现自闭症样行为，包括刻板行为和社会缺陷，以及焦虑样行为，但没有表现出智力障碍。

肠通透性提高：与WT小鼠相比，KO小鼠的肠通透性显著提高（图1k）。此外，KO小鼠结肠中紧密连接分子Cldn4的mRNA表达更低，IL-1β（促炎因子）mRNA表达大幅增加，且有抗炎作用的IL-6表达降低，而回肠远端、结肠、肝和肺的形态学没有改变。
 

粪便微生物组成变化：Bray-Curtis距离的主坐标分析表明，KO与WT小鼠的粪便微生物群组成不同（图1p），主要差异在KO小鼠粪便菌群中脱铁杆菌门的粘膜螺旋藻属丰度降低（图1q）。

上述结果表明小鼠EphB6的缺失导致肠道通透性增加和肠道微生物组成发生变化。4周龄KO与WT小鼠的主坐标分析中，肠道菌群组成不同，但3周龄小鼠肠道菌群组成相似。同时4周龄的KO小鼠表现出刻板行为增加和对社交气味兴趣降低，进一步暗示异常行为与EphB6缺失小鼠中肠道微生物紊乱之间的可能关系。
 

图1 | 缺失EphB6导致小鼠自闭症样行为和肠道微生物紊乱

2.移植EphB6基因缺陷小鼠的粪便菌群在C57BL/6J小鼠中引起自闭症样行为
 

将8周龄的雄性WT或KO小鼠粪便菌群灌胃给3周龄SPF雄性C57BL/6J小鼠（图2a），三周后发现两组小鼠肠道微生物组成不同（图2b），同时发现接受KO小鼠粪便微生物群的C57BL/6J小鼠表现出刻板行为增加和社交行为减少（图2e-i）。另外对SPF雄性C57BL/6J小鼠进行抗生素预处理后进行WT或KO小鼠粪便菌群灌胃实验，2周后发现两组小鼠肠道微生物组成不同，而且接受KO小鼠粪便微生物群的C57BL/6J小鼠表现出刻板行为增加和社交行为减少。总之，来自EphB6基因缺陷小鼠的粪便微生物群在C57BL/6J小鼠中引起了刻板行为的增加和社会行为的部分受损。
 

图2 | 移植EphB6基因缺陷小鼠的粪便菌群在3周龄的SPF C57BL/6J小鼠引起自闭症样行为
 

为验证肠道微生物群是否在成年小鼠的自闭症样行为中持续发挥作用，给6周大的SPF C57BL/6J雄性小鼠口服抗生素混合物1周破坏肠道菌群后，小鼠表现出社交能力障碍。作者还发现KO小鼠肠道菌群的代谢产物在C57BL/6J小鼠中诱发了部分社交缺陷（图3j-m）。而KO小鼠中去除代谢产物的肠道菌群也会在C57BL/6J小鼠中引起部分社交缺陷。结果表明即使在成年小鼠中，肠道菌群也与自闭症样行为相关，并且不同的肠道细菌可能参与调节不同的行为。

图3 | 移植EphB6基因缺陷小鼠粪便菌群会诱导6周龄SPF C57BL/6J小鼠的部分社交缺陷

3.移植野生型小鼠粪便菌群改善成年EphB6基因缺陷小鼠的自闭症样行为
 

16S rRNA基因测序结果表明，接受WT小鼠肠道菌群的KO小鼠粪便中脱铁杆菌门的粘膜螺旋藻属相对丰度增加（图4c）。功能分析表明，接受WT小鼠肠道菌群的KO小鼠表现出社交行为增加（图4f-i），且刻板行为有降低的趋势（图4e）。总之，肠道微生物紊乱是导致EphB6缺失小鼠的自闭症样行为的原因。
 

图4 | 移植野生型小鼠粪便菌群改善了成年EphB6基因缺陷小鼠的自闭症样行为

4.肠道菌群介导的维生素B6动态平衡调节EphB6基因缺陷小鼠的社交行为
 

作者通过实验探索肠道菌群影响大脑并在EphB6基因缺陷小鼠中引起自闭症样行为的机制。有研究表明ASD与海马体、小脑和中央前额叶皮层（mPFC）有关，KO小鼠mPFC中c-Fos蛋白表达显著高于WT小鼠。对于某些实验来说mPFC太小，因此后续实验使用了PFC。
 

因为KO小鼠肠道菌群的代谢产物也引起了C57BL/6J小鼠的社交缺陷，作者假设某些受肠道微生物影响的物质会导致KO小鼠的社交缺陷。使用LC-MS非靶向代谢组学方法检测了小鼠PFC中代谢物，发现两组小鼠之间有显著差异（图5a），差异代谢物富集到的代谢通路包括维生素B6代谢途径，主要因为KO小鼠中该途径的吡哆胺（PM）和吡哆醛5'-磷酸（PLP）相对丰度降低（图5b-d）。
 

人体维生素B6主要来自饮食和肠道细菌合成，然后被肠道吸收。检测小鼠粪便、血液和PFC中维生素B6含量发现，EphB6基因缺陷小鼠粪便中吡哆醇（PN）含量升高，血浆PM和PLP含量降低，前额叶皮层PLP含量降低。（图5e-k）。接受WT小鼠肠道微生物移植一周后，KO小鼠粪便中PN含量降低，血浆中PM含量升高，PFC中PLP含量升高。这些结果表明，肠道菌群可能通过调节肠道中维生素B6吸收来调节小鼠粪便、血液和PFC中维生素B6水平。
 

图5 | 肠道菌群调节EphB6缺陷小鼠的维生素B6
 

作者又向KO小鼠补充维生素B6，以阐明其对自闭症样行为的影响。腹腔注射1 mg PLP后一小时，与对照组小鼠相比，KO小鼠的血浆PLP水平较高（图6b），社交行为增加（图6d-f），但相同处理对C57BL/6J小鼠的社交行为没有影响（图6h-j）。另外使C57BL/6J小鼠缺乏维生素B6，2周后血浆PLP水平降低，小鼠社交行为降低（图6k-n）。结果证明了肠道菌群诱导的维生素B6缺乏与EphB6基因缺陷小鼠的社会缺陷之间存在联系。
 

图6 | 肠道菌群介导的维生素B6动态平衡调节EphB6缺陷小鼠的社交行为
 

5.肠微生物群介导的维生素B6动态平衡调节EphB6基因缺陷小鼠脑前额叶皮层中的多巴胺
 

维生素B6参与细胞多个生化反应，包括氨基酸和神经递质生物合成和分解代谢。通过靶向代谢组学检测方法，发现给予无菌PBS或WT小鼠粪便微生物群的WT和KO小鼠PFC中，谷氨酸、（GABA）、甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺水平相似（图7a/b）。与WT小鼠相比，KO小鼠PFC中多巴胺降低、5-羟色胺（5-HT）增加（图7c）。与给予无菌PBS相比，用WT小鼠粪便菌群处理可增加KO小鼠PFC中多巴胺，但不影响5-HT。另外接受KO小鼠粪便菌群移植的SPF C57BL/6J小鼠，PFC中多巴胺水平低于接受WT小鼠粪便菌群移植的小鼠。腹腔内注射PLP可增加KO小鼠PFC中多巴胺水平（图7d），维生素B6缺乏可降低SPF C57BL/6J小鼠PFC中的多巴胺水平（图7e）。总之，肠道菌群介导的维生素B6动态平衡影响小鼠PFC多巴胺水平。
 

向KO小鼠mPFC中注射多巴胺D1受体（D1R）或多巴胺D2受体（D2R）（喹吡罗）的激动剂，发现与注射人工脑脊髓液（ACSF）相比，注射D1R的KO小鼠表现出社交行为增强（图7g-j），但注射D2R的KO小鼠没有。注射ACSF和D1R激动剂的C57BL/6J小鼠没有发现社交行为的差异（图7k-m），但D1R拮抗剂导致C57BL/6J小鼠社交行为的降低（图7n-q）。总之，在EphB6基因缺陷小鼠中肠道菌群失调和维生素B6缺乏可通过D1R介导的途径导致自闭症样行为。
 

图7 | 肠道菌群通过维生素B6调节多巴胺进而影响EphB6基因缺陷小鼠的社交行为
 

6.肠道菌群调节EphB6基因缺陷小鼠中央前额叶皮层中的E/I平衡
 

为研究EphB6基因缺陷小鼠肠道微生物群介导的自闭症样行为的细胞机制，作者记录了接受无菌PBS或WT小鼠粪便微生物群处理的WT和KO小鼠mPFC的锥体神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）和自发抑制性突触后电流（sIPSCs）。sEPSC幅度和频率以及sIPSCs的幅度在各组之间没有差异（图8b-f），而KO小鼠中sIPSCs的频率降低，接受WT小鼠粪便菌群移植可以改善这种情况（图8g-k）。另外，接受KO小鼠粪便微生物处理的C57BL/6J小鼠mPFC的锥体神经元中sIPSC的频率降低。总之，肠道菌群在EphB6基因缺陷小鼠的mPFC锥体神经元中通过多巴胺调节了E/I平衡（图9）。
 

图8 | 肠微生物群和多巴胺调节EphB6缺陷小鼠mPFC中的E/I平衡
 

图9 | 肠道菌群在EphB6基因缺陷小鼠中调节社会缺陷的工作模型

相关讨论
 

首先，本研究表明EphB6在功能上与ASD相关，从建立的转基因小鼠模型中发现小鼠EphB6的缺失诱导了自闭症样行为，研究还揭示了EphB6在ASD中的功能，EphB6基因缺陷小鼠可以用作ASD研究的新小鼠模型。

第二，本研究发现肠道微生物紊乱是EphB6基因缺陷小鼠自闭症样行为所必需的。通过移植KO小鼠粪便菌群，抗生素处理的C57BL/6J小鼠也可出现部分相似行为。研究还表明，肠道菌群在治疗成人患者ASD核心症状方面可能发挥作用。敲除EphB6可能会诱导Eph家族和连接蛋白之间相互作用失调，从而导致小鼠肠道粘膜通透性增加和肠道微生物菌群紊乱。

第三．缺乏维生素B6对于EphB6基因缺陷小鼠肠道微生物群介导的自闭症样行为至关重要。研究发现肠道菌群对维生素B6调节的新作用，并证实肠道菌群介导的维生素B6改善了EphB6基因缺陷小鼠的社会缺陷。

第四，作者建立了EphB6基因缺陷小鼠中肠道菌群与脑功能障碍（肠脑轴）连接的机制。作者发现EphB6基因缺陷小鼠中肠道微生物群通过调节维生素B6对PFC中多巴胺起调节作用。另外作者发现D1R激动剂改善了EphB6基因缺陷小鼠的社会缺陷，并改善了这些小鼠mPFC中肠道菌群调节的E/I失衡。D1R可能通过改善EphB6基因缺陷小鼠GABA能抑制来调节它们的社会行为。

总之，肠道菌群介导的维生素B6缺乏引起多巴胺水平降低，进而导致EphB6基因缺陷小鼠的E/I失衡和社交缺陷。
 

实验结论
 

本研究揭示了肠道菌群在EphB6基因缺陷小鼠的自闭症样行为中的关键作用。从机理上讲，肠道微生物群介导的维生素B6缺乏通过降低EphB6基因缺陷小鼠中央前额叶皮层中的多巴胺水平和诱导E/I失衡来调节自闭症样的社会行为。作者提出了一种新的自闭症谱系障碍（ASD）小鼠模型，证明了肠道菌群在遗传因子诱导的自闭症中的重要作用，并为肠道-大脑-菌群轴提供了新的见解，这些发现为理解和治疗ASD提供了新策略。
 

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一篇高分文章，离不开明确地研究目的、精巧周密地实验设计和多种分析手段有机结合，这篇文章就是其中的典范。文章研究的核心问题——肠道菌群与自闭症行为的关系，需要通过多项实验方案，将小鼠的行为学、组织电生理学、肠透性等表型结果，与蛋白质\转录组等检测结果相互应征，更加入了16S rRNA基因测序和非靶向/靶向代谢组学这两项研究肠道微生物与宿主关系必不可少的分析手段，最终提出了肠道菌群影响小鼠脑功能缺陷的新机制，揭示了肠脑微生物群轴对ASD的发展有重大影响的巨大潜力。
 

看点
 

欧易/鹿明生物推出的16s+代谢组学的多层组学研究思路继本篇文章前已先后助力了浙江工业大学、中国农科院、青岛农业大学等在微生物一区顶刊Microbiome、医学一区顶刊GUT发表文章。详情请戳项目文章PBP | 浙江工业大学傅正伟运用GC-MS非靶向代谢组学和16S探究水稻根际微生物群落影响项目文章 | 恭喜中国农科院及青岛农业大学团队继GUT后又喜发微生物顶刊Microbiome。

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