案例一：SMART 体系：GS9 作为转录激活因子控制水稻粒型和外观品质
研究背景
水稻的粒形是水稻产量和品质的关键决定因素之一。一般而言，大粒径高产但品质差。因此水稻育种的一个重要目标是高产加理想的粒形。目前的研究已经克隆了几个控制水稻粒形的基因的主效 QTL，其中大多数基因控制颗粒大小和产量，但对于外观品质改善有限，并且对这些基因的调控机制和调控网络研究并不清晰。因此，筛选决定粒形的其他基因 / QTL，对于进一步揭示谷粒性状分子决定机制、培育高产优质品种具有重要意义。
研究内容
本研究从籼粳亚种间来源的染色体片代换系中，克隆了一个新的控制稻米粒长基因 GS9。利用酵母双杂交文库，发现 GS9 能够与 OsOFP14 和 OsOFP8 相互作用；双荧光素酶报告进一步表明，OsOFP14 反馈抑制 GS9 的表达；利用近等基因系及衍生的聚合系，证明 GS9 与其他已知粒形基因的表达互不影响，遗传分析证实 GS9 调控粒形的效应独立于 GS3 和 GW5 等已知基因。研究显示，该基因在高产水稻粒形和外观品质改良的分子育种中，具有很高的应用潜力，这项成果将为解决我国稻米优质高产难题提供重要的理论依据与技术支撑。
本文酵母文库和转录组测序由欧易生物完成。
图-1 研究思路
图-2 OFP 与 GS9 互作并抑制其转录激活活性
研究结果
1. 水稻染色体片段置换系 CSSL N138 具有和日本晴相同的粒重，但粒形更为细长。利用 F3 群体进行图位克隆，最终将这一基因锁定在 9 号染色体，并命名为 GS9 (Grain Shap Gene on Chromosome 9)。
2. 携带有 GS9 基因的日本晴背景的近等基因系 NIL-gs9 同样具有更为细长的粒形。在利用 CRISPR/Cas9 技术敲除 GS9的品系中，粒形表现为更细长；而在 GS9 过表达的品系中，表现为圆形籽粒。
3. NIL-gs9 与日本晴小穗颖壳相比，横向细胞数量减少，但细胞大小增加。推测 NIL-gs9 粒形变得更为细长，是由于小穗颖壳中纵向细胞长度的增大和横向细胞数量减少导致的。
4. 酵母双杂交文库筛选到 GS9 能够与 OFP8/14 相互作用。进一步发现，GSK2 能够与 OFP8 互作。双荧光素酶报告实验证明 OFP14/8 能够抑制 GS9 的转录激活活性，并且这种抑制能被 GSK2 补救。OFP8 受油菜素内酯信号通路关键因子OsGSK2 激酶的磷酸化调控，而 OsGSK2 不能与 GS9 和 OFP14 互作。
5. 为进一步研究 GS9 对基因表达的影响，对 NIL-gs9 和日本晴进行了转录组测序，结果显示 GS9 突变会导致一系列基因的变化，尤其是 DNA 结合和细胞分化相关基因。比较有意思的是，虽然上述研究表明 GS9 可以和 OFP 家族蛋白结合，但在 RNA 层面上，GS9 的突变并未引起 OFP 基因的表达变化。
6. GW5 和 GS3 是两个已经报道的可以控制水稻粒形的基因，为了研究它们与 GS9 之间的关系，将携带 GW5、GS3 的NIL 与 NIL-gs9 杂交，后代表现出更为细长的粒形，表明 GS9、GW5、GS3 对于粒形的决定具有加性效应；突变 gs9 对于其他粒形决定基因没有影响，表明相互之间没有直接的关联。
7. 通过多次回交将 gs9 导入 WYJ8 和 WYJ27 品系，或采用 CRISPR/Cas9 对 Y8 品系 GS9 基因进行编辑，子代均表现出更为细长的粒形。
参考文献
Zhao D S, Li Q F, Zhang C Q, et al. GS9 acts as a transcriptional activator to regulate rice grain shape andappearance quality. Nat Commun 2018; 9(1): 1240. (IF: 12.353).
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