SSH 技术的原理和方法

SSH 是抑制性 PCR 与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法 . 该方法

运用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链 DNA 在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低

的单链 DNA ，从而使原来在丰度上有差别的单链 DNA 相对含量达到基本一致 . 而抑制 PCR

则是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类

似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性抑制非目的基因片段的扩增 . 这

样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制性 PCR 技术进行了高效率的动力学富集 ..
第 1 步 : SSH 技术首先将由 mRNA 逆转录来的检测子 cDNA(Tester) 和驱动子cDNA(Driver)

分别用同一种识别四碱基序列的限制性内切酶 Rsa Ⅰ 消化形成平均长度大于500 bp 的 cDNA

片段，这样可增加有差别表达基因检出的可能性，以防止长链片段形成的复杂结构对消减杂交

的干扰.

第 2 步 : 连接接头 (Adaptor). 将 Tester cDNA 均分为两份，分别接上接头 Adaptor 1 和

Adaptor2. Adaptor 设计十分巧妙，由一长链 (40 nt) 和一短链 (10 nt) 组成的一端是平端

的双链 DNA 片段，且双链 5' 端均无磷酸化基团，保证了 Adaptor 以惟一方向与 cDNA 片段

连接 . 接头外侧序列与第 1 次 PCR 引物序列相同，而内侧序列则与第 2 次 PCR( 巢式

PCR) 引物序列相同，有利于后续 PCR 的筛选扩增 . 此外接头上含有Ｔ 7 启动子序列及内切

酶识别位点，为以后克隆和测序提供方便 .

第 3 步 : 两轮消减杂交 . 用过量 Driver cDNA 样品与上述两份连有接头的 Tester cDNA

样品进行第 1 次消减杂交，分别得到 4 种产物 . 这种不充分杂交使得单链 cDNA 分子在浓

度上基本相同 . 同时由于 Tester cDNA 与 Driver cDNA 序列中相同片段大都形成异源双链

分子 c ，使得 Tester cDNA 中差异表达基因得到第一次富集 ; 然后混合上述两份杂交样品

，同时加入新的变性 Driver cDNA 进行第 2 次消减杂交 . 此次杂交只有第 1 次杂交后经扣

除和丰度均等化的单链 Tester cDNA 能与 Driver cDNA 形成双链分子 . 这一次杂交进一步

富集了差异表达的 cDNA ，并且还形成了 2 个 5 ′ 端分别接不同接头的双链分子 e .

第 4 步 : 两次 PCR 反应 . 5' 端填平末端，加入根据接头设计的引物进行两次 PCR. 第 1

次 PCR 基于抑制反应，只有两端连接有 2 个不同接头的双链 cDNA 片段 ( 如ｅ ) 才能得到

指数扩增 . 第 2 次 PCR 实际上是巢式 PCR ，极大地提高了扩增特异性，使差异表达的目的

基因片段得到大量富集 . 然后利用接头上存在的酶切位点，插入适当载体，转化细菌，初步

筛选出具有插入的克隆，再经杂交筛出具有差异表达的克隆，进行测序、同源分析等系列工作

，最后完成全长基因的克隆、鉴定 .