SEARCH
技术服务021-34781616

热门搜索关键词:转录组基因组甲基化酵母文库蛋白芯片

021-34781616

当前位置:首页 » 新闻资讯 » 技术&解读&应用 » 2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

前言

在植物研究领域,植物逆境研究一直都是热点,在人口众多,环境多样性复杂的地球生态中,获得有优良抗性的品种,对于农作物,经济作物,观赏植物都是极具科研和经济价值的。在这一领域,酵母双杂交技术因为其广谱适应性、实验操作易行、成本相对较低等特点,发挥了重要作用。小编会从低温胁迫,高温胁迫,盐胁迫,干旱胁迫,抗病虫害5个方面举例说明。今天先介绍低温胁迫,案例选自欧易生物客户2019年发表的文章

 

案例 · 1

项目文章

An apple MYB transcription factor regulates cold tolerance and anthocyanin accumulation and undergoes MIEL1-mediated degradation--Plant Biotechnology Journal

 

研究内容

文章中发现MdMYB308L可以与MdbHLH33相互作用,同时可以增强MdbHLH33与MdCBF2 (耐寒相关基因)和 MdDFR(花青素合成相关基因)启动子的结合性,提高基因表达量,对苹果抗寒性和花青素积累具有正向调控作用。而MdMIEL1(MYB30-INTERACTING E3 LIGASE 1)可以与MdMYB308L互作,促进其泛素化降解,对苹果抗寒性有负调控作用。作者通过正负调控和正反验证实验,明确阐释了MdMYB308L在苹果抗寒反应中的作用机制

 

2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

 

A working model illustrating that MdMYB308L functions in cold stress response and anthocyanin accumulation.

 

研究思路和实验方法

阶段一通过转录组测序,找到了低温胁迫后差异表达基因MdMYB308L。然后在单基因功能层面,使用MdMYB308L过表达和抑制表达的转基因愈伤组织和模式植物拟南芥,从抗寒表型和花青素积累上进行了直接研究。(低温胁迫处理方法可见原文)

 

阶段二,从正调控上研究MdMYB308L是如何起作用的。有文献报道,MdbHLH33在苹果抗寒和花青素积累上也均起正调控作用,提出假想MdMYB308L是否是通过直接与MdbHLH33发生互作,发挥其生物学功能的?在证明两个蛋白是否互作上,首先就使用了酵母双杂交技术,验证结果为阳性。接着通过pull-down、BiFC进一步验证,结果阳性。

2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

 

MdMYB308L与MdbHLH33在酵母细胞中互作实验结果

 

在MdMYB308L过表达和抑制表达转基因植株中,MdbHLH33表达量并无明显差异,而通过EMSA实验发现,MdMYB308L原来是通过促进MdbHLH33对下游基因的激活作用,实现抗寒和花青素积累功能的。而且,通过沉默MdbHLH33基因,在过表达MdMYB308L转基因植株抗寒表型和花青素含量上仍有一定增加,说明MdMYB308L的靶基因不止MdbHLH33一个

 

阶段三,从负调控上研究MdMYB308L是如何起作用的在该阶段,不得不说酵母双杂交实验发挥了至关重要的作用。作者将MdMYB308L作为诱饵,通过酵母双杂交实验筛选苹果文库,获得了阳性互作基因MdMIEL1。并通过一对一互作验证,进一步证明了这两个基因在酵母细胞中存在互作。

2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

 

MdMYB308L与MdMIEL1在酵母细胞中互作实验结果

 

MdMIEL1编码RING E3泛素连接酶,有文献报道MdMIEL1在抗氧化、抗盐胁迫以及花青素积累上都起负调控作用。且证实MYB30,MYB98 和MYB1是MIEL1的泛素化底物。于是,作者又提出假想:MdMIEL1是否也对MdMYB308L进行了泛素化修饰,调控其蛋白降解呢。结果通过体内外泛素化模式实验证实了假想成立,同时对MdMIEL1过表达和抑制表达的转基因植株(母株为MdMYB308L过表达的苹果愈伤和拟南芥植株)的抗寒表型、花青素含量检测分析进一步证实了结论。

 

案例 · 2

项目文章

BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2 Negatively Regulates the Stability of Transcription Factor ICE1 in Response to Cold Stress in Arabidopsis--The Plant Cell

 

研究内容

为了研究BIN2(BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2)在植物应对低温胁迫反应过程中的作用机制,本文以酵母双杂交实验作为切入方法开展研究具体为以BIN2为诱饵基因,将其构建于pGBKT7载体并转化进AH109酵母细胞中,筛选野生型拟南芥cDNA文库,获得了阳性互作基因ICE1并进一步验证了ICE1截断体与BIN2的互作情况,在酵母细胞中证明是ICE1蛋白C端结构与BIN2存在相互作用。另外,BIN2的同源基因BIN2-LIKE1和BIL2在酵母细胞中也与ICE1互作,且通过pull-down和Co-IP实验进行了证实。

2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

 

BIN2与ICE1及ICE1截断体在酵母细胞中互作实验结果

 

故事的开头讲完了但接下来的剧情是如何发展的呢?因为BIN2是一种蛋白激酶,所以作者提出假想,BIN2与ICE1互作,是否就是将ICE1磷酸化了呢?如果是,磷酸化后的ICE1会有什么功能性变化呢?

 

ICE1(INDUCER OF CBF EXPRESSION)从名字可看出,该蛋白是CBF蛋白表达的诱导物,也就是说ICE1作为转录因子可与CBF启动子结合,激活CBF的表达(文章中也通过EMSA实验进行了验证,CBF 是植物抗寒相关重要基因,在案例1中也有研究到其同源基因MdCBF2 )。

 

我们都知道蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的机制。蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上,一种是丝氨酸,另一种是酪氨酸。而作者也通过体内外磷酸化实验,证明了BIN2确实是与ICE1互作且使ICE1磷酸化了,其主要的磷酸化位点为ICE1S94A以ICE1S94A突变体进行对比研究,发现在低温锻炼减弱期(复苏期)BIN2通过使ICE1磷酸化,促进其与E3泛素连接酶HOS1结合,加快ICE1的泛素化降解进程,导致CBF表达下调,实现植物在抗寒与生长之间的平衡(意思就是春天到了,冰雪消融,可以开始茁壮生长了)。而在低温锻炼初期,BIN2表达量是低水平的,ICE1含量较高,促使CBF高表达,增强植物抗寒能力(冬天来了,该冬眠了)。

 

2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

 

图 | 该文阐释的抗寒胁迫中BIN2相关基因互作调控网络

Proposed Model of the Role of BIN2 in Modulating Cold-Stress Responses through Regulating ICE1 Stability in Arabidopsis.

 

看完以上2个案例,是否收获了酵母文库研究新思路?

 

转眼便是樱花季,往年此时早已万物复苏,欣欣向荣

 

2020已过1/4,欧易生物先后为科研工作者们送上了一波波福利,各位都有用准确姿势接收嘛?不管怎样,如果想做酵母双杂交,请随时来撩 ,我们初心不忘,一直都在!

 

END


本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物

欧易生物

技术热线:021-34781616 咨询热线:4006-4008-26

上海市闵行区新骏环路138号5幢3层
service@oebiotech.com
欧易生物
欧易生物微信公众号
沪ICP备-050455 网站地图  Copyright © 2016 上海欧易生物医学科技有限公司 保留所有权利