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测序常见图谱分析(一)

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浏览:- 发布日期:2016-11-23 10:03:15【

测序公司发送的测序结果一般有一个峰图文件和一个序列文件,峰图文件为abi格式,可用chromas软件打开。四种颜色的波形代表四种碱基的信号强度。 正常的峰图,波峰与波谷清晰,峰与峰之间的距离均匀, 比较理想的测序结果在底部应该没有杂峰干扰。

测序结果的前几十bp的数据不太可靠,在拼接序列或序列比对时需要先去除这部分,以免影响分析结果。

测序公司给出的峰图在超过800bp后的各种波之间会有重叠,波峰有钝化现象,碱基与碱基间的距离有时突然加大,这些现象都会影响结果的准确性,只能做为参考。所以说800bp左右是比较有效片段。

测序拿到的峰图可能并不会是理想的单一峰,会出现各种不同类型的峰图,下面就让我们一起来了解一些常见的峰图产生的原因及解决方法。

1、双克隆

现象:前半部分峰图单一,后边片段出现套峰。

原因:PCR产物不纯;挑克隆时,两个不同的菌落混在一起。对策:重新挑单克隆。

2、重叠峰

现象:从一开始就出现两套峰,每个峰下面都有其他颜色的杂峰。原因:PCR主带与杂带混在一起测序,有非特异的PCR产物;模板有两个引物结合位点,同时与引物结合。对策:胶回收,重新测序;重合测序引物。

3、引物二聚体

现象:前面噪音高,后面正常。

原因:引物二聚体未去除干净。

对策:割胶纯化。

4、 引物模板不纯

现象:整个峰图噪音都比较高。引物不纯会造成移码现象,该种现象与模板不纯在峰图都表现为背景峰较杂,引物不纯在峰图上表现的更有规律,一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。

原因:引物(模板)纯度太低,含有较多杂质。

对策:重新合成引物或使用PAGE纯化的测序引物。

另外还有一些常见的酒精峰、染料峰、钉子峰、碱基缺失以及某些特殊结构的峰图,这些我们下篇再说。

未完待续

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    【本文标签】:测序 高通量测序 二代测序 基因测序 测序图谱
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