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环状RNA的形成受到RNA结合蛋白Quaking的调控

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浏览:- 发布日期:2016-11-04 09:14:58【

1.研究背景和生物学问题

环状RNA(circRNA)是动物细胞中广泛存在的一种非编码RNA形式,分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶的影响,表达稳定,不易降解。已有的研究表明,circRNA的表达具有细胞特异性,这也就预示着它们在形成过程中是受到调控的,也从一定程度上说明了它们是具有特定功能的。目前,对于circRNA的研究主要围绕着两个问题:形成过程受什么调控?功能是什么?本文中,作者阐明了在EMT过程中circRNA的形成调控机制,发现了RNA结合蛋白Quaking在circRNA在形成过程中的促进作用,初步建立了circRNA的形成调控模型。

2.研究流程图

3.取材

人类乳腺上皮细胞(HMLE),间充质化的人类乳腺上皮细胞(mesHMLE)

HEK 293T细胞,MDA-MB-231细胞

4.研究技术

转录组测序,双荧光筛选技术,siRNA,shRNA,RIP

5.具体研究过程

1)在人类EMT过程中,circRNA的形成受到调节

人类乳腺上皮细胞(HMLE)在上皮间充质转变(EMT)前后, circRNA的形成受到了一定的调节。测序分析发现,在HMLE中,有5178种circRNA,而在mesHMLE中,circRNA种类显著增加到8084种,其中两者共有3417种circRNA。在EMT前后,mRNA的水平变化不大,但circRNA显著增加,经qRT-PCR验证确认mesHMLE中的许多circRNA显著升高。

2)circRNA形成过程中起重要作用的调节因子的筛选

构建得到双色荧光筛选系统—circScreen,该系统在circRNA形成时表达GFP,在线性mRNA形成时表达mCherry。利用siRNA敲降RNA结合蛋白,通过检测绿色荧光与红色荧光的比例变化,筛选得到与circRNA形成有重要联系的调控因子QKI。同时,在EMT过程中也发现QKI蛋白显著升高。

3)QKI通过结合pre-mRNA内含子上的结合位点调控circRNA的形成

在SMARCA5 pre-mRNA 上circRNA形成区域的上下游,分别存在两个潜在的结合位点,若同时突变上游或下游两个结合位点,或四个结合位点同时突变,均会极大减少circRNA的形成。所以,QKI蛋白通过结合SMARCA5 pre-mRNA 上结合位点,促进circRNA的形成。当对QKI进行敲降或过表达时,circRNA的形成发生相应的下调或上调。

4)在内含子区域特异性插入QKI结合位点,可促进circRNA的形成

作者选择四个基因SYT8, ADD3,TIMP1, 和 NACAD,该四个基因不能在HMLE, mesHMLE, MDAMB-231, 和 HEK293T中形成circRNA。构建得到包含基因三个外显子和QKI结合位点的质粒,在HEK293细胞中过表达,通过RT-PCR验证发现,在这些细胞中存在circRNA的形成。

6.结论

在EMT过程中,Quaking通过结合pre-mRNA上的特定结合位点,促进circRNA的形成。随着Quaking表达量升高,circRNA的数目和表达量也随之增加。

7.参考文献

Simon J. Conn, Katherine A. Pillman, Gregory J. Goodall, et al. TheRNA binding protein Quaking regulates formation of circRNAs. Cell, 2015, 160, 1125–1134.

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    【本文标签】:环状RNA circRNA 结合蛋白
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