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扩增子测序简介

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浏览:- 发布日期:2017-09-11 09:24:17【

概述 扩增子测序是一种高靶向性方法,用于分析特定基因组区域中的基因变异。PCR产品(扩增子)的超深度测序可以有效地识别变异并对其进行特征分析。总体思路是靶向地捕获目标区域,然后进行新一代测序(NGS),分析测序结果,得到相应信息。

扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S /ITS某个高变区域的序列,来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异,对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用,同时也是系统发育和分类学研究中一种广泛使用的方法,特别是应用于不同的宏基因组学样本中。

扩增子测序整体路线:

扩增子测序原理:

下面以QIAGEN扩增子测序试剂盒为例,简单介绍一下原理。PCR扩增是扩增子测序的主要方法,因为通过PCR扩增,可以将目的DNA片段进行富集。但是,PCR扩增和测序过程中可能存在错误,最终会导致测序结果中的假阳性。为了克服PCR扩增中引入的人源误差,在进行任何扩增之前,将UMIs(unique molecular indices)并入起始DNA材料中,从而保留起始DNA分子的唯一性并克服PCR扩增带来的问题,以及文库构建过程中引入的偏差。

每一个原始的DNA分子都带有独特的UMIs。在分析数据时,同样的UMIs就是来源于同一条DNA。真实的多样性,所有相同的UMIs连接的DNA中都有同一的多样性位点,若仅有其中的一个或者几个UMIs含有多样性位点,此多样性可判断为假阳性,因此此方法具有良好的准确性、特异性、灵敏性和通用性。

扩增子测序应用领域: (1)癌症基因测序:靶向癌症测序侧重于一组精选的基因、基因区域或扩增子,它们与癌症有着已知的关联,预先设计的集合和定制集合都可用于研究目标靶向基因; (2)疾病筛查:使用NGS可通过同时评估多个基因来发现遗传病的致病变异,与传统方法相比,使用NGS可降低成本,因为传统方法通常成本较高且不确定,同时需要大量测试; (3)植物和动物测序:预设的基因组区域靶向重测序可以发现动物和植物中的基因变异,这些变异可能代表了有益的突变,可以帮助做出育种决策,还可能揭示与疾病易感性相关的突变。

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