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膜体系酵母双杂中的载体选择

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浏览:- 发布日期:2016-11-30 15:52:57【

膜体系酵母双杂交体系中根据诱饵蛋白质定位不同,需要选用不同的载体,以便于与互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16可以相互作用,从而被泛素特异性蛋白酶(UBPs)识别、切割、启动报告基因表达。根据诱饵蛋白结构特点,Dualsystems Biotech公司设计了四种诱饵(Bait)载体。

这四种载体分别是在什么情况下使用呢,小编在此进行了总结。

1. 如果所选择的诱饵蛋白是N端位于胞质,C端位于细胞器腔内(或者胞外),那么建议使用载体pBT3-N构建诱饵克隆。下图是该种蛋白结构的示意图。

2. 如果诱饵蛋白是C端位于胞质,N端位于细胞器腔内(或者胞外),且N端含有信号肽,那么建议使用载体pBT3-SUC构建诱饵克隆,这是因为某些哺乳动物细胞的信号肽在酵母中无法识别,而pBT3-SUC中含有一段酵素转化酶(SUC2)基因序列,当其定位在诱饵蛋白N端,能够确保诱饵蛋白正确定位到酵母细胞膜上。看一下它的载体图谱,你会更清楚噢。

从上图中可以看出,cDNA插入位点(sifI位点)的上游为SUC2,下游为Cub-LexA-VP16。即表达后诱饵蛋白N端含有SUC,而C端含有Cub-LexA-VP16,确保了诱饵蛋白能够顺利定位在膜上,且与互作蛋白的NubG相互作用。

3. 如果你的诱饵蛋白是C端位于胞质,N端位于细胞器腔内(或者胞外),且N端不含信号肽,推荐使用pBT3-STE。

4. 如果你的诱饵蛋白N端C端均位于胞质,则pBT3-N和pBT3-STE皆可,可以通过后期功能分析二者择一。

以上是对诱饵载体选择的总结,酵母双杂的另一半是猎物蛋白,在构建猎物cDNA文库时,载体怎么选择呢?

膜体系的猎物(Prey)cDNA文库有两种,即NubG-X文库和X-NubG文库,所用载体分别为pPR3-N和pPR3-C。这两种文库的区别是,NubG-X文库融合NubG编码序列到cDNA5'末端产生NubG-cDNA的融合。(即,NubG在猎物蛋白N端。)X-NubG文库融合NubG编码序列到cDNA3'末端产生cDNA-NubG的融合。(即,NubG在猎物蛋白C端。)通常情况下,我们建议选择前者---NubG-X。这是因为由于相对后者,NubG-X的文库丰富度更高约107个独立克隆,插入片段更大,平均大小超过1.5Kb。当然,如果是已知猎物蛋白为I型膜蛋白(即上文中提到的C端位于胞质,N端位于胞外或细胞器腔内)则选择后者X-NubG。下图是这两种文库所使用的载体图谱。

好了,关于膜体系酵母双杂载体选择你是不是已经清楚了呢?然而,虽然已经知道什么情况下选择何种载体合适,但是你对感兴趣的蛋白的结构是了解多少?如果不知道,且听小编下回教你如何预测膜蛋白结构, N端、C端到底在哪儿以及N端有无信号肽!

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    【本文标签】:酵母文库 膜体系酵母双杂 酵母双杂交 膜体系酵母双杂交 膜体系酵母双杂交文库
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