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【外泌体专题】——如何搞定外泌体样本

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浏览:- 发布日期:2017-05-22 09:53:54【

外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构,内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞,都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来,在血液等体液内传播,最后又可被其他细胞吞噬,是细胞间通讯的重要介质。越来越多的研究发现,宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。

随着对外泌体功能的报道越来越多,研究外泌体的科学家也越来越多,欧易生物为了满足广大外泌体研究者的需求,推出了外泌体的miRNA芯片测序项目。做过生物实验的人都知道,好的样本意味着实验已经成功了一半。那么如果开展外泌体miRNA测序芯片项目,如何收集样本并送样呢?下面我们针对不同的样本做个简单介绍。

注意事项:

1. 用于分离外泌体的样品不能加入任何RNA保护剂(如Trizol)。

2. 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察,只能冰上或4℃保存,存放时间不超过两天,注意不可冷冻保存,否则可能会影响电镜观察效果。

3. 冻存过的血浆和血清样本可以用于分离外泌体,并进行电镜观察。

4.准备分选外泌体的样本的预处理十分重要,必须保证有效去除所有细胞碎片及其它不需要的膜结构。因此要求全血不可冻融,取血后尽早制备血浆或血清,血浆或血清可以放-80℃保存,但应避免反复冻融。

1. 血清样品

注意:收集血清样本一定不要加入抗凝剂。

血清是血液凝固析出的淡黄色透明液体。

1) 轻轻将全血滴入洁净的离心管或用采血管采血(不能加抗凝剂)。

2) 室温静置30分钟,4℃条件下,静置3~4小时,可见血块析出(也可放置 4℃冰箱过夜)。

3) 4℃条件下,1900×g离心10分钟,可见淡黄色血清,取出上清后可再4℃条件下,3000×g离心10分钟,最大程度保证血清质量。

4) 将血清冻存于-80℃。

5) 干冰寄送样本。

提示:为保证实验结果,送样量最好4 mL 以上(大致需全血8-10mL)

2. 血浆样品

注意:收集血浆样本用于操作RNA一定不要用肝素抗凝管。因为肝素会影响后续的酶反应。

1) 用采血针和抗凝管(含EDTA)抽取全血,轻柔混匀后于室温或4℃保存。最好在1小时内进行下一步处理。

2) 4℃条件下,1900×g离心10分钟,小心取上清即为血浆,最后500μL左右丢弃。得到的血浆再次离心,条件为4℃,3000×g,15min,小心吸出血浆,注意不要碰到底部和侧面的沉淀物。

3) 将血浆冻存于-80℃。

4) 干冰寄送样本。

提示:送样量最好4 mL以上(大致需全血8-10mL)。

3. 细胞上清

注意:细胞培养基必须使用去除 exosome(de-exosome)的血清或者无血清培养基(例如Thermo Fisher的SFM)

1) 细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间,贴壁细胞密度在70%-80%,悬浮细胞密度在60%-70%。

2) 对于贴壁细胞,去除原有培养基,换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基;对于悬浮细胞,300×g,4℃,10分钟收集细胞,使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。

3) 细胞继续培养24-48小时,根据细胞的生长速度确定收取上清时间。

4) 收集细胞上清,300×g,4℃,离心10分钟;小心吸取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片。

5)3000×g,4℃,再次离心15分钟,确保将细胞或者细胞碎片去除干净。

6) 取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片(重要!),合并相同的细胞培液上清样品,装入无菌的玻璃瓶,可在4℃短期保存(1-2天),长期保存可冻存于-80℃。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离,保存在4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。

提示:送样量最好在15-20 mL 以上

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