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【外泌体专题】——外泌体miRNA与脂肪

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浏览:- 发布日期:2017-06-22 09:36:02【

脂肪来源的循环miRNA调节其他组织中的基因表达

简介

MicroRNA是19-22个核苷酸长的非编码RNA,通常是翻译的负调节物并参与许多细胞过程。许多miRNA存在于体液循环(Circulation)以及组织中,其中大部分存在于外泌体(从多泡体释放的50-200nm囊泡)中。特定miRNA水平的增加已经与多种疾病相关,包括癌症,糖尿病肥胖症和心血管疾病。 miRNA在许多细胞的分化和功能中具有重要作用,包括脂肪组织中的细胞。

脂肪组织是能量储存的主要部位,并且通过释放脂肪因子来调节代谢的作用。由于miRNA加工酶Dicer的减少,白色脂肪组织(White Adipose Tissue,WAT)miRNA的数量随着年龄的减少而下降,同样的原因,在与HIV相关的脂肪营养不良的人类中也观察到类似的降低。

为了更清楚地了解miRNA在脂肪中的作用,作者使用Cre-lox基因重组策略在脂肪组织中产生特异性缺乏Dicer的小鼠(图1a)。

该文显示,在具有微小RNA(miRNA)加工酶Dicer(ADicerKO)的脂肪组织特异性敲除的小鼠以及具有脂肪营养不良的人当中,显示出循环的外泌体miRNA水平的显著降低。ADicerKO小鼠在脂肪组织中表现出miRNA加工的缺陷,导致WAT降低,棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)的白化,胰岛素抵抗和循环脂质的改变。将白色和棕色脂肪组织(尤其是棕色)移植到ADicerKO小鼠中恢复了许多循环miRNA的水平,其与葡萄糖耐量的改善和肝脏Fgf21 mRNA和循环FGF21的降低有关。这种基因调控可以通过给予正常但不是ADicerKO的血清外泌体来模拟。人特异性miRNA在一只小鼠活体内棕色脂肪组织中的表达也可以通过血清外泌体转移到另一只小鼠,调节其肝脏中的3'UTR报告基因。因此,脂肪组织构成循环外泌体miRNA的重要来源,其可以调节分隔组织中的基因表达,从而成为一种新的脂肪因子形式。

结果 脂肪组织是循环miRNA的主要来源

作者通过差异超分离从6个月大的雄性ADicerKO和野生型对照小鼠的血清中分离了外泌体。与对照小鼠相比,ADicerKO小鼠的422个外泌体miRNA有显著改变,其中三个miRNA显著增加,而419个显著降低,且88%降低了四倍以上。

图1 | 脂肪组织是外泌体miRNA的主要来源

脂肪移植重组循环miRNA

为了验证脂肪组织是循环miRNA的重要来源,作者将脂肪从正常小鼠移植到ADicerKO小鼠(图2a)。与ADicerKO小鼠相比,在野生型小鼠血清中可检测到177种循环外泌体miRNA的显著降低,脂肪移植可将其大多数恢复至正常水平的至少50%。生理学上,与野生型小鼠相比,ADicerKO小鼠的葡萄糖耐量显著降低,曲线下面积大致增加了50%(图2d,e)。

图2 | 脂肪库对循环外泌体miRNA的贡献

循环外泌体miRNA可能调节FGF21

在肝脏和其他组织中产生成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)。其释放到循环中会影响多种组织中的代谢。ADicerKO小鼠表现出循环FGF21大约三倍的增加,这与肝脏,肌肉,脂肪和胰腺中Fgf21 mRNA的水平升高有关(图3a)。WAT移植后,ADicerKO小鼠血清FGF21和肝脏Fgf21 mRNA水平保持不变(图3c,d)。然而,在BAT移植后,ADicerKO小鼠的肝脏中Fgf21 mRNA的水平降低了约50%(图3d)。这与循环FGF21的量(图3c)的减少并行发生,表明BAT移植提供了直接或间接调节肝脏中FGF21表达的一些因子。

为了测试这些miRNA在外来体中的表达是否能够调节FGF21的表达,作者将表达Fgf21 3'UTR荧光素酶报告基因的AML-12细胞暴露于野生型或ADicerKO小鼠的外来体,或已(用miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-466i或对照模拟物)电转化的ADicerKO外泌体。作者发现来自对照小鼠的分离的外来体可以在体外抑制60%的Fgf21 3'UTR-荧光素酶活性,而来自ADicerKO小鼠血清的外来体没有作用(图3e)。FGF21的这种调节依赖于外源性递送,当细胞与裸露的miR-99b一起孵育时,不重现(图3e)。

图3 | 脂肪产生的外泌体miRNA调节肝脏FGF21和转录

为了研究体外外源miRNA对Fgf21 mRNA的调控,作者用pacAd5-FGF21-3'-UTR-荧光素酶报告基因转染了ADicerKO和野生型小鼠,并使用IVIS体内成像系统测定了肝FGF21表达的抑制。与体外获得的数据一致,在ADicerKO小鼠体内Fgf21 3'UTR活性高于野生型小鼠,反映在ADicerKO小鼠中不存在阻抑性循环miRNA(图4a,b)。将野生型外来体注射入ADicerKO小鼠将FGF21升高的报道活性抑制了约60%。这证实了qRT-PCR结果,其显示与未处理的ADicerKO小鼠相比,肝Fgf21 mRNA升高降低,循环FGF21降低(图4c,d)。

在单独的实验中,我们将野生型和ADicerKO小鼠与来自ADicerKO小鼠的外来体注射,有或没有重建miR-99b(图4e)。 ADicerKO小鼠再次注射来自ADicerKO小鼠的外来体时,野生型小鼠的荧光素酶活性高2.5倍。 用miR-99b重建的ADicerKO外来体的施用对Fgf21 3'UTR报道重新诱导抑制45%的正常方式(图4f)。 伴随着肝Fgf21 mRNA(图4g)和循环FGF21的量的平行减少(图4h)。

图4 | 通过外源miR-99b体内调节FGF21

调控外源miRNA的肝脏基因表达

FGF21的调控是一个复杂的过程,涉及多个因素。为了评估脂肪衍生的循环miRNA在体内的作用,作者开发了一种更具体的报道系统,其利用人特异性miRNA hsa_miR-302f及其3'UTR报告基因,因为该miRNA不具有小鼠同源物。然后作者进行了两种实验。

在第一个方案(方案1;图5a)中,作者将携带pre-hsa_miR-302f或对照序列的腺病毒载体直接注入BAT中以诱导转染基因的BAT特异性表达。三天后,作者用hsa_miR-302f的带有3'UTR荧光素酶报告基因的腺病毒静脉注射相同的小鼠,以诱导其在肝脏中的表达。只有在BAT中表达的miRNA与肝脏中表达的报告基因之间存在沟通时,才会观察到抑制报道。转导后5天的IVIS分析显示,与用lacZ转染的BAT(对照)的小鼠相比,与miR-302f转染的小鼠的肝脏中的荧光素酶活性相比,其BAT中的荧光素酶活性降低超过95%(图5b,c)。

在第二个方案(方案2;图5d)中,为了明确地解决hsa_miR-302f介导的肝组织中的报告物抑制是否取决于外泌体递送,作者使用两个单独的C57BL/6小鼠队列。将第一个队列用携带pre-hsa_miR-302f或lacZ的腺病毒直接转染入BAT(供者队列)。通过静脉内注射携带3'UTR hsa_miR-302f报告物(受体群组)的腺病毒转导第二个分开的小鼠组的肝脏。然后作者在随后的8天内从供体队列中获得血清,分离出外泌体,将纯化的外源体静脉内注射到受体小鼠中,并对3'UTR hsa_miR-302f报告物进行IVIS分析。与使用lacZ转染BAT的小鼠接受外来体的小鼠相比,注射了用hsa_miR-302f转染BAT的供体外泌体的受体小鼠在肝脏中显示出95%的荧光素酶活性降低(图5e ,f),证明在脂肪组织中产生的这种循环的外来miRNA调节受体小鼠肝组织中其报道物的活性。

图5 | 表达人miRNA miR-302f的BAT衍生的外泌体在肝脏中靶向其报告物

脂肪的新作用及其潜在影响

作者的数据显示,脂肪组织是循环外泌体miRNA的重要来源,不同的脂肪库对循环贡献不同的外泌体miRNA。 作者的数据还显示,这些脂肪来源的循环miRNA可以具有深远的全身效应,包括对mRNA表达和翻译的调节(图5g)。 由于这些miRNA是由不同的脂肪库产生的,所以它们的水平也可以改变具有脂肪量变化的疾病,例如脂肪营养不良和肥胖,或改变脂肪分布和功能,如糖尿病和衰老。 因此,脂肪来源的外泌体miRNA构成了可以作为远处组织代谢调节剂的先前不知道的脂肪因子类,提供了细胞间串扰的新机制。


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