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当前位置:首页 » 新闻资讯 » 欧易动态 » 项目文章 | Molecular Cancer:circCCDC9 通过 ceRNA 机制抑制胃癌进展
基本信息
5 月 9 日,上海交通大学医学院附属第一人民医院普外科黄陈主任医师作为通讯作者,在 Molecular Cancer(IF 10.679)发表了题为“Circular RNA circCCDC9 acts as a miR-6792-3p sponge to suppress the progression of gastric cancer through regulating CAV1 expression”研究论文,系统研究了环状 RNA circCCDC9 在胃癌进展中的作用机制。
这也是继去年 8 月份之后(可点击查看详情),该课题组再次在 Molecular Cancer 上发表胃癌领域 circRNA 研究成果。文章中全转录组测序服务工作由欧易生物完成。

研究背景
胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,由于对早期胃癌的筛查不足和疾病的隐匿性,多数患者初诊即已处于胃癌晚期。目前胃癌的预后仍不尽人意,因此探究胃癌发生发展的具体分子机制,对于胃癌的诊治具有重要意义。

环状RNA(circular RNA, circRNA)是真核生物中一类重要的内源性非编码 RNA,近些年研究表明 circRNA 广泛参与肿瘤的发生和发展,影响肿瘤的生长增殖和侵袭转移等过程。以胃癌为例,circNHSL1 就是一个与胃癌转移相关的 circRNA 分子,通过 circNHSL1/miR-1306-3p/SIX1 轴调控了胃癌转移。但胃癌中 circRNA 的作用和功能仍有待深入研究。


研究结果
1、circCCDC9 在胃癌组织中表达下调
首先对 6 个胃癌样品和配对的癌旁样品进行全转录组测序,共检测到 12450 个 circRNA,在肿瘤组织中有 52 个 circRNA 表达上升、33 个表达下降(下左图)。其中表达下调最为显著的一个 circRNA 是 Has_circ_0000944,它由基因 CCDC9 外显子 6 和外显子 7 反向剪接形成,因此将此 circRNA 命名为 circCCDC9。

利用 RT-PCR 在 48 个胃癌样品中进行检测(右上图)、利用原位杂交(ISH)在 54 个胃癌样品中进行检测,均显示该 circRNA 表达量发生了显著下调。与正常胃上皮细胞系相比,不同的胃癌细胞系中 circCCDC9 表达量也明显降低(右下图)。circCCDC9 表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期呈负相关,与胃癌患者预后呈正相关。
为了证明 circCCDC9 是环状 RNA,利用 divergent 和 convergent 两对引物,并通过一代测序(下图 A)、以 cDNA 和 gDNA 为模板进行 PCR(下图 B)、RNase R 处理(下图 C)的方法得以验证。亚细胞定位显示 circCCDC9 主要分布于细胞质中。

2、circCCDC9 在体外可以抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭
为了研究 circCCDC9 在胃癌中的作用,在 MKN45 细胞中利用 siRNA 对 circCCDC9 进行 knockdown,但不影响 CCDC9 mRNA 的表达水平(图 B);在 AGS 细胞中过表达 circCCDC9(图 C)。knockdown circCCDC9 后,结果显示细胞增殖能力增强(图 D-F),wound healing 和 transwell 实验显示细胞的迁移、侵袭能力也得以增强(图 G-H),过表达 circCCDC9 则呈现相反趋势。

3、miR-6792-3p 在胃癌中高表达并与肿瘤进展和预后相关
为了研究 circCCDC9 对胃癌的调控机制,并考虑到 circCCDC9 主要分布于细胞质中,文章从 ceRNA 的角度进行探索。首先利用生物信息分析的手段预测有 5 个 miRNA 可以靶向到 circCCDC9,RT-PCR 显示只有其中的 miR-6792-3p 在细胞和组织中均与 circCCDC9 表达量呈负相关(图 B-D)。分析也显示 miR-6792-3p 与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期呈正相关,与胃癌患者预后呈负相关(图 G)。

4、miR-6792-3p 通过靶向 CAV1 促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭
接下来研究 miR-6792-3p 的作用。多个软件共同预测显示 miR-6792-3p 可能靶向的基因有 6 个,其中的 CAV1 是一个已报道的与胃肠道癌进展相关的基因。在胃癌细胞系中转入 miR-6792-3p mimic 以提高 miRNA 表达量,RT-PCR 显示 CAV1 表达量显著下降(图 B)。同时利用荧光素酶报告系统检测显示,miR-6792-3p 可以与 CAV1 序列直接结合,而不能结合碱基突变的 CAV1(图 C-D)。检测结果还表明,miR-6792-3p 过表达后,肿瘤细胞增殖能力增强,细胞的迁移、侵袭能力也得以增强。而通过转入 miR-6792-3p inhibitor 降低表达量则呈现相反趋势。

5、circCCDC9 作为 miR-6792-3p 的分子海绵以调控 CAV1 的表达
上述结果表明在胃癌进展中,circCCDC9、miR-6792-3p、CAV1 都有变化,接下来研究它们三者之间的调控关系:
  1. RT-PCR 和 WB 显示,knockdown circCCDC9 可以下调 CAV1 的 mRNA 和蛋白质表达水平,下调 miR-6792-3p 可以挽救 CAV1 的上述表达下降(图 A)。同样,过表达 circCCDC9 可以上调 CAV1 的 mRNA 和蛋白质表达水平,上调 miR-6792-3p 可以抑制 CAV1 的上述表达上升(图 B)。
  2. 荧光原位杂交显示,circCCDC9 与 miR-6792-3p 共定位于细胞质(图 C)。
  3. 荧光素酶报告实验表明,miR-6792-3p 可以直接结合 circCCDC9,而不能结合含突变碱基的 circCCDC9(图 D)。
  4. RIP-PCR 显示,靶向 Ago2 蛋白的抗体可以同时 pull down 到 circCCDC9 和 miR-6792-3p(图 F-G)。
  5. 生物素标记的 circCCDC9 探针可以 pull down 到 miR-6792-3p,生物素标记的 miR-6792-3p 探针也可以 pull down 到 circCCDC9(图 H-I)。
  6. RT-PCR 显示,胃癌组织中,circCCDC9 与 CAV1 表达正相关、circCCDC9 与 miR-6792-3p 表达负相关、CAV1 与 miR-6792-3p 表达负相关。
  7. 同时细胞实验证实,由 circCCDC9 所引起的肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变,可以被 miR-6792-3p 所抑制。
以上结果表明 circCCDC9 通过直接结合 miR-6792-3p 以上调 CAV1 表达,以 ceRNA的机制参与对胃癌肿瘤进展的调控。

6、体内过表达 circCCDC9 可以抑制肿瘤生长与肝转移
以上均是在体外进行的研究,接下来为了研究 circCCDC9 在体内是否起到同样的调控作用,将过表达 circCCDC9 的 AGS 细胞接种到裸鼠。接种 28 天后,过表达 circCCDC9 的裸鼠肿瘤体积与重量显著低于对照组(图 A-C),RT-PCR 显示 CAV1 表达量显著高于对照组。构建肝转移模型,显示过表达 circCCDC9 的裸鼠肝转移程度较低。
 
研究结论
 
本研究通过全转录组测序,发现了一个胃癌进展相关的 circRNA 分子——circCCDC9,体内体外实验表明,它对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭起到抑制作用。进一步的机制研究表明,circCCDC9 对胃癌的抑制作用是通过 circCCDC9/miR-6792-3p/CAV1 轴实现的:circCCDC9 作为 ceRNA,竞争性结合 miR-6792-3p,从而间接调控了 CAV1 的表达水平。circCCDC9 和 miR-6792-3p 均有望成为胃癌预后的 biomarker,为胃癌的诊断和治疗提供了新的分子靶点。

参考文献
Luo Z, Rong Z, Zhang J, et al. Circular RNA circCCDC9 acts as a miR-6792-3p sponge to suppress the progression of gastric cancer through regulating CAV1 expression. Mol Cancer 2020; 19(1): 86. (IF: 10.679).

 
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本文系欧易生物原创
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