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甲基化差异分析利器:Methyl-RAD

2016-09-26 09:36:09 

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组DNA的一种重要的表观遗传学修饰,通过调控基因的表达模式,参与调节机体对环境的适应过程。

获得全基因组范围内所有胞嘧啶位点的甲基化数据,对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。基于高通量测序平台的检测方法由于对甲基化位点的检测具有更高的敏感度和通量,已经成为DNA甲基化检测的主流平台。

目前,基于高通量测序平台的全基因组甲基化分析方法主要包括:全基因组亚硫酸氢盐测序(whole genome bisulfite sequencing, WGBS)、简化的亚硫酸氢盐测序(reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq)等。以上这些技术都只适用于有参考基因组的物种,并且实验流程较为复杂。

2015年发表在《Open Biology》上的MethylRAD技术,可以实现无参考基因组物种的全基因组差异甲基化分析。

MethylRAD技术流程

MethylRAD利用一类类似IIB型的甲基化修饰依赖性内切酶,如FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI等,此类内切酶会识别DNA上甲基化位点,在识别位置的下游隔一定距离进行酶切;如果DNA两条链甲基化状态是对称的,那么就可以切割产生一个固定长度的片段(~32bp)。对这些片段回收测序,就可以进行甲基化位点的定性和相对定量检测。

图1 MethylRAD技术流程图

建议测序数据量

按照每1G基因组大小,测序30M reads(X-ten平台,PE150)

技术优势

  • 文库构建简便快速,保证了实验的重复性、标签的代表性。

  • 甲基化位点检测的假阳性率能够控制在0.5%以内(作为金标准的WGBS方法假阳性率在0.28%-0.50%)

  • 低水平甲基化位点依然有较高检出率

  • 与WGBS检出吻合率高

  • 具有单碱基分辨率,可以做到甲基化位点的定性和相对定量分析

  • 对于DNA质量要求不高:建库起始DNA量最低可至1ng,降解样品(如FFPE样品)也可检测

  • DNA甲基化位点的检出不依赖于基因组序列信息,既可以用于未知甲基化位点的开发,也可用于不同样本间的甲基化位点的差异研究

  • 具有极强的灵活性,可以控制获得甲基化位点的密度

技术比较

生物信息学分析内容

1.对原始测序reads进行去除接头、去除低质量及污染序列的处理

2.MethylRAD测序序列与参考基因组序列的比对(注:该分析只针对有参考基因组物种)

3.MethylRAD测序数据的全基因组分布趋势(注:该分析只针对有参考基因组物种)

  • MethylRAD测序reads在全基因组每条染色体上的分布(注:该分析只针对染色体信息齐全的物种)

  • MethylRAD测序reads在全基因组上的覆盖深度

  • MethylRAD测序reads在CCGGG、CCWGG位点上的覆盖深度(注:W表示A或T)

  • MethylRAD测序reads在不同基因功能元件(如启动子、外显子、内含子、UTR区等)上的分布

  • MethylRAD测序reads在基因元件及其上下2000bp的平均覆盖深度分布趋势

  • 绘制全基因组范围甲基化谱

4.甲基化位点信息分析

  • 检测CCGG和CCWGG的甲基化位点,统计甲基化位点数目

  • 评估CCGG和CCWGG中的C的甲基化水平(注:计量单位为RPM,即reads per million)

  • 提供甲基化位点的标签序列

5.全基因组甲基化差异分析

  • 差异甲基化位点的筛选统计

  • 差异甲基化位点在不同基因功能元件上的分布

  • 分析两组样品间的甲基化水平差异位点的相关基因

  • 对两组样品间的差异基因进行GO功能富集分析及pathway功能分析

6.定制化数据分析

  • 与mRNA数据联合分析

  • 与miRNA数据联合分析

应用案例

部分虾夷扇贝的闭壳肌颜色存在由白色突变为橙色的现象,为了研究其调控机制,利用MethylRAD技术,分别对12个白色闭壳肌个体、12个橙色闭壳肌个体分别进行甲基化检测。在两组样品中共鉴别到6万多个CCGG位点和400多个CCWGG位点,其中148个位点的甲基化水平存在显著差异(p<0.05)。对于差异最为显著的4个甲基化位点(图2),结合RNAseq数据,最终锁定与类胡罗素的累积相关的LPCAT1基因,具体决定机制有待后续验证。

图2 全基因组差异甲基化位点

参考文章

1.Wang S, Lv J, Zhang L, et al. MethylRAD: a simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylation-dependent restriction enzymes. Open Biol, 2015, 5(11): pii:150130

2.Cohen-Karni D, Xu D, Apone L, et al. The MspJI family of modification-dependent restriction endonucleases for epigenetic studies. PNAS, 2011, 108(27): 11040-11045.

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