前言
2020年12月9日，上海交通大学医学院附属仁济医院倪兆慧教授为通讯作者，在Autophagy期刊（IF = 9.77）上发表了题为“Inhibiting NLRP3 inflammasome attenuates apoptosis in contrast - nduced acute kidney injury through the upregulation of HIF1A and BNIP3 - mediated mitophagy”的研究论文，报道了抑制NLRP3可以促进线粒体自噬进而缓解急性肾损伤细胞凋亡的分子机制。文章中转录组测序和分析由欧易生物完成。
研究背景
血管内造影剂的使用可导致造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI），常规抗氧化和碱性治疗对CI-AKI患者并无益处。据报道CI-AKI的病因包括造影剂iohexol诱导的肾小管上皮细胞的氧化应激、内皮损伤和收缩血管激素分泌的细胞毒性作用。因此，阐明CI-AKI的分子机制将有助于开发新的预防和治疗策略。
据报道，NLRP3炎症小体在AKI小鼠模型和人类肾脏疾病中被激活，并进一步促进肾损伤和凋亡。其功能包括抑制线粒体自噬和调节线粒体功能。但NLRP3炎性小体在AKI中调节线粒体自噬的作用尚不清楚。
本研究旨在通过CI-AKI小鼠模型中的NLRP3或CASP1敲除，探讨NLRP3炎性小体在调控线粒体自噬中的作用。此外，通过RNA测序，确定NLRP3炎性小体在CI-AKI小鼠模型中调控的信号通路，以检测CI-AKI的潜在治疗靶点。
据报道，NLRP3炎症小体在AKI小鼠模型和人类肾脏疾病中被激活，并进一步促进肾损伤和凋亡。其功能包括抑制线粒体自噬和调节线粒体功能。但NLRP3炎性小体在AKI中调节线粒体自噬的作用尚不清楚。
本研究旨在通过CI-AKI小鼠模型中的NLRP3或CASP1敲除，探讨NLRP3炎性小体在调控线粒体自噬中的作用。此外，通过RNA测序，确定NLRP3炎性小体在CI-AKI小鼠模型中调控的信号通路，以检测CI-AKI的潜在治疗靶点。
研究内容
本研究通过对小鼠肾皮质组织进行转录组测序，发现与对照组相比，NLRP3或CASP1基因敲除的CI-AKI小鼠对缺氧、线粒体氧化和自噬的细胞反应上调，表明NLRP3炎症小体抑制导致缺氧信号通路和线粒体自噬上调。NLRP3或CASP1基因敲除的CI-AKI小鼠模型和细胞模型经MCC950（NLRP3抑制剂）预处理后，HIF1A、BECN1、BNIP3和LC3B- II表达水平上调，线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的数量增加。HIF脯氨酸羟化酶抑制剂（roxadustat），在体内和体外通过稳定HIF1A和激活下游BNIP3介导的线粒体自噬来保护肾小管上皮细胞免受造影剂iohexol诱导的损伤。此外，BNIP3缺乏显著降低了线粒体自噬，并加重了细胞凋亡和肾损伤。提示BNIP3介导的细胞自噬对CI-AKI具有保护作用。本研究阐明了NLRP3炎性小体抑制CI-AKI细胞凋亡、上调HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬的新机制。此外，本研究还论证了MCC950和roxadustat在临床CI-AKI治疗中的应用潜力。
研究结果
NLRP3或CASP1缺失可减轻iohexol诱导的肾损伤和凋亡
在CI-AKI小鼠建模过程中，发现造影剂iohexol促进NLRP3、CASP1 p20和IL1B p17的表达（图A-B）。但敲除NLRP3 或CASP1时（图1C），CI-AKI小鼠的血肌酐水平减低（图1D）；肾损伤降低（图1E-F），肾小管上皮细胞凋亡的数量减少（图1 G-J）。该结果表明NLRP3炎症小体在CI-AKI小鼠中被激活，敲除NLRP3或CASP1可减轻iohexol诱导的肾损伤和细胞凋亡。
图1 NLRP3或CASP1敲除可减轻iohexol诱导的肾损伤和凋亡
iohexol通过HIF1A和BNIP3促进肾小管上皮细胞的线粒体自噬
为了鉴定CI-AKI中NLRP3调控的信号通路，分别对WT、NLRP3敲除（nlrp3-/-）和casp1敲除（casp1-/-）的 CI-AKI小鼠的肾皮质进行RNA测序（图2A）。差异基因功能KEGG富集分析表明，敲降NLRP3可降低炎症反应、促进自噬（图2B-C）。此外，GO分析显示，NLRP3和CASP1可通过调节细胞对缺氧、线粒体氧化和自噬的反应来减少细胞凋亡（图2D-I）。据报道，缺氧可调节线粒体自噬和细胞凋亡。由此，作者检测了HIF1A及其下游效应因子（BNIP3）在线粒体自噬中的作用，以评估NLRP3炎性小体在凋亡中的作用。
图2 转录组测序分析
透射电子显微镜（TEM）分析显示，iohexol诱导的WT CI-AKI小鼠肾小管上皮细胞中有线粒体自噬体的形成（图3A）。免疫荧光分析显示，在WT CI-AKI小鼠肾小管中LC3B与BNIP3和VDAC的共定位均增强，VDAC与LAMP1共定位增强，暗示肾小管的BNIP3表达增加与线粒体自噬体及线粒体自噬溶酶体数量增加相关（图3B-E）。HIF1A、BECN1、BNIP3和LC3B-II的表达水平上调（图3F-G）。这表明iohexol通过激活肾小管上皮细胞的HIF1A和BNIP3来促进线粒体自噬。
图3 iohexol通过HIF1A和BNIP3促进肾小管上皮细胞的线粒体自噬
抑制NLRP3或CASP1可上调HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬，减轻了CI-AKI小鼠的线粒体损伤
进一步研究NLRP3缺失对HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬的影响。相比WT CI-AKI小鼠，nlrp3-/-或casp1-/- CI-AKI小鼠肾皮质中HIF1A、BECN1、BNIP3和LC3B-II的表达水平升高（图4A-B）；BNIP3介导的线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的数量增加（图4C-F），线粒体损伤情况减轻（图4G）。该结果表明，抑制NLRP3炎症小体可上调HIF1A和NLRP3介导的线粒体自噬，减轻CI-AKI线粒体损伤。RNA测序数据、qRT-PCR和WB结果均显示，与野生型CI-AKI小鼠肾皮质相比，nlrp3-/-或casp1-/- CI-AKI小鼠肾皮质中EGLN2的表达下调（图4H-I）。由此表明，抑制NLRP3炎症小体可下调EGLN2的表达，上调HIF1A的表达。
图4 抑制NLRP3或CASP1可上调HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬，减轻CI-AKI小鼠的线粒体损伤
MCC950上调HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬，减少细胞凋亡
基于细胞模型，即用NLRP3炎症小体抑制剂（MCC950）处理后肾小管上皮细胞（HK-2），再用iohexol处理。MCC950处理减轻了iohexol引起的细胞活力下降（图5A），HIF1A、BECN1、BNIP3和LC3B-II表达水平上调，VDAC表达水平降低（图5B-C）；BNIP3介导的线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的数量增加（图5D-G）；减轻了iohexol诱导的肾小管上皮细胞凋亡（图5H-J）。由此表明，NLRP3、CASP1敲除或MCC950处理，均可上调HIF1A和BNIP3介导线粒体自噬作用，进而缓解iohexol诱导肾损伤。
图5 MCC950上调HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬，减少细胞凋亡
Roxadustat激活CI-AKI小鼠HIF1A-BNIP3信号通路，减少细胞凋亡
为了检测HIF1A及其下游效应物在CI-AKI中的功能，作者使用HIF脯氨酸羟化酶抑制剂（roxadustat）处理CI-AKI小鼠后（图6A），小鼠的血清肌酐水平显著降低（图6B），肾损伤降低（图6C-D），HIF1A、BECN1、BNIP3和LC3B-II的表达水平升高（图6E-F）；线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体数量增加（图6G-J），线粒体损伤减轻（图6K），细胞凋亡减少（图6L-O）。上述结果表明roxadustat可促进BNIP3介导的线粒体自噬，减轻CI-AKI的肾损伤和细胞凋亡。对roxadustat处理的CI-AKI小鼠的肾皮质进行RNA测序。nlrp3-/-或casp1-/- CI-AKI均与roxadustat CI-AKI小鼠之间存在共有表达基因（图6P），暗示着roxadustat在CI-AKI中的作用可能与敲除NLRP3或CASP1类似。
图6 Roxadustat激活CI-AKI小鼠HIF1A-BNIP3信号通路，减少细胞凋亡
在细胞实验中，即用roxadustat预处理HK-2细胞后，再暴露于iohexol。roxadustat减轻了iohexol引起的细胞活力下降（图7A），促进HIF1A、BECN1、BNIP3和LC3B-II的表达，降低VDAC的表达（图7B-C），促进了bnip3介导的线粒体自噬（图7D-G），减少细胞凋亡（图7 H-J）。然而，3-MA预处理抑制了roxadustat介导的凋亡衰减（图7H-I）。由此表明，roxadustat通过激活HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬，减轻了iohexol诱导的肾损伤和凋亡。
图7 Roxadustat通过上调线粒体自噬水平，在体外保护HK-2细胞免受iohexol诱导的凋亡
BNIP3的敲除可促进iohexol诱导的肾损伤和凋亡
为了研究BNIP3介导的CI-AKI细胞自噬的调节，作者构建bnip3-/- CI-AKI小鼠模型（图8A-B）。与WT相比，bnip3-/- CI-AKI小鼠血清肌酐水平升高（图8C），肾小管损伤加重（图8D-E），LC3B-II 表达下调（图8 H-J），线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的数量明显减少（图8J-L），受损线粒体增多（图8M），细胞凋亡增加（图8N-Q）。
图8 BNIP3的敲除可促进CI-AKI小鼠线粒体损伤和凋亡
在细胞实验中，即HK-2细胞经BNIP3敲降后暴露于iohexol，发现细胞活力下降（图9A），VDAC的表达受到抑制（图9B-C），线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的数量明显减少（图9D-G），细胞凋亡增加（图9H-J）。由此表明，BNIP3介导的线粒体自噬对iohexol诱导的肾损伤有保护作用，而BNIP3的敲除可促进iohexol诱导的肾损伤和凋亡。
图9 沉默BNIP3可下调HK-2细胞的线粒体自噬，促进细胞凋亡
研究总结
本研究表明抑制NLRP3炎症小体可增强HIF1A和BNIP3介导的线粒体自噬的保护作用，从而减轻iohexol诱导的细胞凋亡和肾损伤。MCC950和roxadustat均可增强BNIP3介导的线粒体自噬，抑制肾小管上皮细胞凋亡，揭示了MCC950和roxadustat有望作为临床预防和治疗CI-AKI的潜在治疗靶点。
图10 CL-AKI中NLRP3炎性小体、HIF1A和BNIP3介导的细胞自噬和细胞凋亡示意图
参考文献
Qisheng Lin, et al. Inhibiting NLRP3 inflammasome attenuates apoptosis in contrast-induced acute kidney injury through the upregulation of HIF1A and BNIP3-mediated mitophagy. Autophagy. 2020, 19: 1 - 16.
doi:10.1080/15548627.2020.1848971
doi:10.1080/15548627.2020.1848971
