前言
2020年10月，中国科学院遗传与发育生物学研究所程祝宽研究员、南京农业大学吴玉峰教授为共同通讯作者，在Plant Cell杂志（IF=9.618）发表题为“Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6 Contributes to Double-Strand Break Formation in Meiosis”的研究论文，该研究对OsRDR6（Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6）参与水稻减数分裂DSB（双链断裂，Double-strand Break）形成的分子机制做了深入探索。博士研究生刘长振、助理研究员沈懿、以及已毕业的覃宝祥博士为论文的共同第一作者。文章中 RNA-seq、small RNA 测序、WGBS 由欧易生物提供服务。
据悉，程祝宽研究员长期从事水稻减数分裂方面的研究，在该领域取得一系列原创性科研成果，国际上享有盛名；而作为青年一代的吴玉峰教授，回国以后在计算生物学领域已发表多篇具有影响力的科研论文。
研究背景
由于在抗病毒防御中的作用，植物RNA依赖性的RNA聚合酶（RDR）被广泛研究，RDRs的作用与相关的DICER类蛋白和AGO（Argonaute）蛋白功能密切相关。RDR6是RDR家族中的一个重要成员，其在small RNA介导的基因沉默过程中发挥着极其重要的功能。已有的研究表明RDR6在PhasiRNA (Phased small interfering RNA) 以及TasiRNA (Trans-acting small interfering RNA)的合成过程中发挥作用，并因此参与到抗病以及器官发育等多个过程。然而，目前对OsRDR6在减数分裂中的作用机制仍不清楚。
研究内容
本文基于一个可引起减数分裂特异表型的 OsRDR6 新等位突变体Osrdr6-meiosis (Osrdr6-mei ) 展开一系列研究，解释了RDR6参与减数分裂过程中DSB形成的基本机制。作者首先将 OsRDR6 的野生型基因组序列导入纯合Osrdr6-mei 突变体中，在遗传上证实突变体的不育是由 OsRDR6 基因突变所引起。进而通过基因敲除（CRISPR-CAS9）以及等位杂交实验构建了双等位突变体Osrdr6-bi，发现OsRDR6对于减数分裂DSB形成是必不可少的。Osrdr6-mei 中small RNA的表达变化表明，水稻减数分裂过程中small RNA的合成调控依赖于RDR6。此外，WGBS分析还发现OsRDR6对small RNA的调节作用显著影响全基因组DNA甲基化水平。在 Osrdr6-mei 中，small RNA表达差异导致与DSB形成相关的三个基因下调，这可能就是突变体中减数分裂DSB形成异常的原因。
研究路线
研究结果
1. 水稻不育突变系特性研究
首先，采用籼稻品种中籼3037获得不育突变株，其表现出正常的营养生长，却完全不育。自交杂合植株后代中可育株与不育株的分离比例为3：1，表明不育表型受1对隐性核基因控制。进一步将目的基因定位在1号染色体的长臂上，发现1个候选基因编码水稻中的RDR6蛋白，故将该突变体命名为 Osrdr6-mei。
图1 Osrdr6-mei 表型分析
2. 水稻DSB形成需要OsRDR6
通过染色体行为分析和荧光原位杂交(FISH)实验确认Osrdr6-mei 花粉母细胞中的部分同源染色体在粗线期不能配对，在终变期可明显检测到单价体（不能配对的同源染色体）。进一步通过对花药进行半薄切片实验发现Osrdr6-mei 的花粉母细胞在减数分裂后期逐渐开始解体，表明减数分裂细胞可能已经凋亡。采用特异性识别磷酸化形式的水稻组蛋白γH2AX抗体进行免疫荧光染色来监测DSB形成，结果表明突变体中DSB的数目显著减少。
图2 Osrdr6-mei的细胞学分析
为进一步证实OsRDR6在减数分裂DSB形成中的作用，作者进一步构建了Oscom1 Osrdr6-mei 双突变体。当 OsCOM1 功能丧失会导致非同源染色体粘连（这类非同源染色体的粘连是由于DSB修复异常所致，故粘连的发生依赖于DSB的形成），而在双突变体中，异常染色体粘连的现象受到部分抑制。该结果在遗传上证实 Osrdr6-mei 中形成的DSB较少。
3. 双等位突变体Osrdr6-bi分析证实OsRDR6是DSB形成所必需
利用CRISPR-CAS9系统及等位杂交技术创建的双等位突变体Osrdr6-bi，其不育表型与生长状态同 Osrdr6-mei 类似。Osrdr6-bi 中，在减数分裂粗线期没有观察到同源染色体配对，且超过90%的减数分裂过程均受阻。
图3 Osrdr6-bi 的遗传构建和细胞学分析
由于ZEP1是水稻联会复合体（Synaptonemal Complex, SC）的重要成分，对其进行免疫荧光染色发现：在 Osrdr6-bi 中ZEP1信号呈点状分布，表明 Osrdr6-bi 中SC的形成不正常。且在 Osrdr6-bi 中没有观察到明显的γH2AX信号，表明DSB的形成被完全阻断。11号染色体全长FISH以及DSB修复相关的其它蛋白免疫荧光染色实验也证实OsRDR6对于减数分裂DSB的形成是必需的。
图4 野生型和 Osrdr6-bi 减数分裂细胞的FISH和免疫荧光染色分析
4. Osrdr6-mei 突变体对small RNA生物合成的影响
细线期花药small RNA测序结果显示，small RNA的长度在21-nt有一个主峰，在24-nt处有一个较小的峰。在 Osrdr6-mei 中，21-nt small RNA数量显著低于野生型，而24-nt small RNA数量显著高于野生型。进一步的分析表明，在 Osrdr6-mei 中表现出最显著丰度降低的21-nt small RNA主要来自于基因组中的 phased 位点和未注释区域，而在 Osrdr6-mei 中丰度显著上调的24-nt small RNA来自基因座、重复相关区域和未注释区域。
图5 来自small RNA测序的大小分布、注释和空间分布
通过分析位于基因和转座元件(TE)位点附近的small RNA发现，与野生型相比， Osrdr6-mei 有更少的21-nt small RNA，却有更多的24-nt small RNA，推测OsRDR6调控减数分裂花药中的small RNA表达。
5. Osrdr6-mei 的DNA甲基化提升
对野生型和 Osrdr6-mei 花药进行WGBS，结果显示，在 Osrdr6-mei 中的非TE基因上下游1kb和TE附近区域CHH甲基化水平要高得多，而且在 Osrdr6-mei 中发现了更多的CHH高DMR，揭示OsRDR6可能在DNA甲基化中起负作用。
图6 DNA甲基化与small RNA之间的关系
在 Osrdr6-mei 中，CHH 高DMR对应的24-nt small RNA和21-nt small RNA的丰度明显更高；在CHH低DMR对应的24-nt small RNA的丰度同样更高，这意味着24-nt small RNA与DNA甲基化之间存在较为复杂的关系。
6. Osrdr6 突变体中 CRC1、P31comet 和 OsSDS 的表达水平降低
转录组测序共鉴定出778个差异表达基因，其中321个基因上调，457个基因下调。有422个(54%)与差异表达的24-nt small RNA有关。这些结果提示与 OsRDR6 相关的small RNA可能对基因表达有普遍性地影响。
图7 在 Osrdr6 突变体中，CRC1、P31comet 和 OsSDS 下调表达
重点基因 CRC1、P31comet 和 OsSDS 是水稻减数分裂DSB形成所必需的，这些基因都是显著下调的，荧光定量PCR结果也证实相同的变化趋势。通过免疫荧光染色实验发现，CRC1 和 P31comet 蛋白在 Osrdr6-bi 的花粉母细胞染色体中未检测到信号，推测 OsRDR6 可能通过调节水稻中 CRC1、P31comet 和 OsSDS 的表达水平来调控减数分裂DSB的形成。
7. Osrdr6-mei 上下调基因受不同途径调控
通过联合分析观察DEG周围small RNA丰度变化，推测在 Osrdr6-mei 中，启动子和3’调控区24-nt small RNA表达的增加可能与基因沉默(下调)有关，而相关基因的上调可能是21-nt和24-nt small RNA表达差异的综合结果。
由于植物中small RNA结合到AGO蛋白是由其5’末端核苷酸类别所介导，而映射到相关基因启动子和3’调控区上的24-nt small RNA的5’末端核苷酸都偏向腺嘌呤，表明这些small RNA中的大多数可结合到AGO2或AGO4蛋白上。
从small RNA在上调基因周围区域的分布来看，其调控机制比下调基因更为复杂。DMRs结果中相关的差异基因不包括CRC1、P31comet 和 OsSDS，这表明这些与减数分裂相关的基因表达水平改变，不是直接由small RNA介导的DNA甲基化水平改变所致，这其中的具体作用机制还有待继续深入研究。
研究结论
本文为OsRDR6在调节减数分裂DSB形成提出了一个潜在模型。在野生型中，OsRDR6与其他small RNA合成蛋白共同合作，以维持绒毡层细胞和减数分裂细胞中small RNA表达的平衡。在 Osrdr6-mei 中，OsRDR6功能异常导致24-nt small RNA表达升高，特别是在下调基因的启动子和3’调控区，并因此导致这些基因的表达水平降低。此外，这些24-nt small RNA更有可能与AGO2/4蛋白相结合并组装成small RNA介导的沉默复合体来抑制这些基因的表达。
编者按
本文克隆了一个新的水稻 RDR6 突变体，Osrdr6-mei ；并解析了其在减数分裂过程中特异产生表型的分子机制。文中，作者首先确认不育性状是由OsRDR6突变引起，其次利用small RNA测序、WGBS和RNA-seq技术，揭示了OsRDR6对于调节减数分裂时期花药中small RNA平衡是重要的。在突变体中，与DSB形成相关的三个基因下调可能是导致突变体存在DSB形成异常表型的原因。这篇文章系统阐述了OsRDR6对于减数分裂DSB形成的重要作用机制，并突出多组学联合分析之间互作关系，十分值得借鉴。
参考文献
Liu CZ, Shen Y, Qin BX, et al. Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6 Contributes to Double-Strand Break Formation in Meiosis[J]. Plant Cell, 2020, 32: 3273-3289.
END
