常见问题
Q1. iTRAQ / TMT 定量蛋白质组和双向电泳技术相比,有什么优势?
双向电泳技术是伴随着 MALDI-TOF 技术发展起来的蛋白质分离技术,理论上可以通过等电点(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差异将总蛋白质逐一分开。但实际情况并不理想,因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见,蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等,一张 2-D胶能鉴定到的蛋白质总数最多 1000 - 2000 蛋白。
相较于2-D以及 DIGE 等基于电泳的技术,iTRAQ / TMT 分辨率高,鹿明生物进行的细胞样品最多有发现超过 6000 个蛋白,并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息;其次 iTRAQ/TMT 通量高,可以一次最多完成 8 或10个不同处理组的实验,特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。
Q2. iTRAQ / TMT 实验的主要步骤有哪些,主要采用哪些仪器,检索的软件及常用数据库有哪些?
实验步骤包括:蛋白提取、浓度测定及 SDS-PAGE 凝胶检测,质检报告;蛋白酶解、标记;一维色谱分离,冻干机冻干;高分辨 LC-MS/MS 质谱检测;搜库定性、定量分析;差异蛋白筛选,差异蛋白生物信息学分析;完整报告整理。
目前鹿明生物的质谱仪器有:Sciex公司 6600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive、Fusion质谱仪。
常用的检索软件有:SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。
常用的数据库有:Uniprot数据库、NCBI数据库、本地自建数据库。
Q3. iTRAQ、TMT、Label free 实验用的是什么质谱仪,其定量是基于一级质谱还是二级质谱?
iTRAQ、TMT、Label free都属于蛋白组学实验,前二者是属于同位素标记定量蛋白组二者的原理都一样;第三个是非标记定量蛋白组。 三者所用的仪器都差不多,主要有:Sciex公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive;
PS: TMT 10标蛋白组只能用thermo公司Q Exactive,不能用AB 5600 做。 Itraq、TMT是基于二级质谱定量,Label free是基于一级质谱定量。
Q4. DIA技术有什么优势?
肽段覆盖率高、定量准确度高、实验重复性好;DIA技术的蛋白定量是基于二级质谱定量,相对于传统的Labelfree技术来说定量准确度更高;对比ITRAQ/TMT技术,DIA技术没有通量限制,可以同时对大样本量样品进行定性定量比较;DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测;DIA技术不需要昂贵的标记试剂,同时克服了标记效率对定量的影响;
Q5. DIA技术需要做技术重复么?
DIA技术需要至少三次生物学重复,特别是临床样本,重复越多越好。
Q6. DIA技术为什么需要重新建库,NCBI和uniport的数据库不能用么?
答:DIA本身是一种扫描的方式,我们常用的技术比如itraq/TMT、Labelfree等都是基于DDA的扫描方式,而且目前的数据库也只适合DDA扫描的出来的质谱数据,所以我们只能人工的建立一个数据库,才能供DIA的数据进行识别。