真核生物转录组测序-欧易生物

真核生物转录组测序

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带

真核生物转录组测序基于高通量测序可全面快速地获得

某一物种特定细胞或组织在某一状态下的所有转录本的集合

用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等

转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控和逆境胁迫适应机制、生物进化规律

疾病发生发展的重要机制以及发现致病基因调控的关键靶点等方面的优先研究手段

欧易特色

具备处理复杂样本的能力

丰富的建库经验，加入文库均一化技术

协助客户快速、高效、准确地进行生物信息分析

可结合客户的需求灵活进行定制化信息分析

真核生物转录组测序（有参考基因组物种）

推荐测序模式

Hiseq X Ten, PE150 6 Gb/每个样本

数据分析内容

真核生物转录组测序（无参考基因组物种）

推荐测序模式

Hiseq X Ten, PE150 10 Gb/每个样本（无参考基因组物种）

数据分析内容

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案例一：肝损伤程度决定肝细胞命运（有参）

研究背景

目前仍缺乏治疗肝细胞癌的有效手段，已证实细胞衰老在抑制癌病变中起重要作用，因此，作者认为细胞衰老可能成为治疗肝细胞癌的潜在靶点。

研究内容

欧易生物携手第二军医大学，探究了肝的损伤程度、肝细胞衰老和癌变三者的关系，其中转录组测序实验和分析工作由欧易生物完成。本研究主要报道了肝细胞衰老可以通过激活免疫监视抑制癌变，肝的损伤程度决定了肝细胞的命运，即走向衰老或者癌变。

研究结果

1. 鉴别细胞衰老的三种手段，发现严重肝损伤处理后（SALI）细胞衰老程度更高。

2. 比较不同肝损伤程度的小鼠的肿瘤表达水平，发现轻度肝损伤处理（MCLI）的癌变作用更明显。因此，肝细胞衰老可能具有明显的抑癌作用。

3. 通过转录组测序发现诱导细胞衰老后，Hippo 信号通路显著富集，巨噬细胞相关基因显著富集。

4. 免疫组化实验发现肝细胞衰老激活了免疫细胞（如巨噬细胞、CD4 + Th1 细胞和 NK cells）的表达，表明衰老可能通过激活免疫监视抑制癌变。

参考文献

Wang C, Chen WJ, Wu YF, et al. The extent of liver injury determines hepatocyte fate toward senescence or cancer. Cell Death Dis 2018; 9(5): 575. (IF: 5.965)

案例二：白鼬基因组序列草图研究（无参）

研究背景

白鼬是一种主要用于研究人类呼吸疾病的动物模型。

研究内容

通过家养白鼬的基因草图组装，构建了 2.28 Gb 的基因组序列；对 21 个白鼬组织的转录组测序，注释了 19910 个蛋白编码基因；不同时间点用 2 个病毒感染 42 个寄主，并取气管和肺组织进行转录组测序研究了寄主的相关反应；用 16 个囊性纤维疾病的芯片数据，揭示 CFTR 敲除白鼬其肺器官早期的转录组变化，并可应用于具有囊性纤维疾病的人类婴儿的研究。

图 1 | 白鼬和人中蛋白序列和组织特异性表达相似

图 2 | 受流感病毒感染和 CF 疾病的白鼬转录谱分析

研究结果

1. 对雌性白鼬进行基因组测序，通过 ALLPATHS-LG 软件进行基因组组装，组装的草图是 2.41 Gb；对不同发育阶段和成熟的雄性和雌性组织的 24 个样本进行 RNA-seq，用 Ensembl 软件进行基因组注释，蛋白基因编码 models 通过Uniprot 哺乳动物和其它的脊椎动物的蛋白序列进行比对和注释；通过注释的蛋白序列构建了系统进化树，发现白鼬属于犬科亚目，系统树分枝的长度表明啮齿类进化枝的快速进化，也说明相对于人和老鼠来说，人和白鼬具有更少的遗传多样性；和基础细胞生理学相关的 GO 注释富集于存在 angular sector 的基因，其中排行前 25% 的白鼬基因同人更接近，这些富集的 GO 注释包括核苷酸代谢、细胞核分裂、表达调控和蛋白修饰及定位。总而言之，白鼬和人的蛋白序列的高度相似性，表明许多白鼬蛋白进化上可能是保守的，同人的同源蛋白具有相似的生物学功能。

2. 通过比较白鼬和人转录丰度的模式研究两者基因是否具有相似的组织表达。对 14 个样品的相似表达模式的基因进行聚类分析，结果表明两者基因的表达模式具有高度一致性和组织特异性；序列比较显示相对于白鼬其它的基因来说，白鼬大脑、骨骼肌肉/心脏、肺和肾里的转录因子和人的同源基因具有更大程度上的相似性，表明这些基因功能调控的高度保守性。

3. 由于人和白鼬呼吸道病毒的受体的相似分布，白鼬经常被用作人流感病毒感染的模型。用两种全球流感病毒感染白鼬，在不同时间点收集气管和肺部组织样品做转录组分析，结果表明寄主在气管组织的转录谱变化更加显著，有 9869 个差异表达基因，而肺部组织只有 4646 个差异表达基因。进一步分析说明，白鼬基因组资源可以比较受到人类流感病毒感染后的转录组变化，同时揭示这种变化在组织分割区依赖的模式不同。

4. 为了研究囊性纤维疾病进程，通过 CFTR 敲除和正常白鼬的肺组织进行芯片检测，找到的差异表达基因的功能分析主要为血液凝结系统、免疫缺陷信号、5-羟色胺受体信号和辅助性T细胞信号。人和白鼬囊性纤维中相似的表达变化在更广泛的生物学功能上也是明显的，诸如慢性免疫紊乱、吞噬细胞的移动和免疫反应。因此白鼬囊纤维可以作为一个可处理的模型，用于系统性地研究受伤位点基因表达进程变化，这一点在人中是不可能的。

参考文献

Peng X, Jessica A, Kevin G , et al. The draft genome sequence of the ferret (Mustela putorius furo) facilitates study of human respiratory disease. Nat Biotechnol 2014; 32(12):1250-1255. (IF: 43.113)

案例三：转录组测序鉴定大豆种子发育进程中的调控网络和核心基因（有参）

研究背景

大豆是世界上种植面积最广的豆科植物，是重要的蛋白质和油料资源。作为重要的作物，粮食产量是大豆育种和种植中最重要的性状。但是与拟南芥和水稻相比，与大豆种子发育相关的转录组数据却是非常有限。

研究内容

欧易生物携手浙江大学，用转录组测序分析了两种基因型大豆在三个早期发育时期种子的基因表达数据，提供了一个种子早期发育阶段全面系统的动态基因表达网络和在控制种子大小的关键基因，为谷物豆类研究提供了有用的基因组资源和分子机制途径。

研究结果

1. 两种品种大豆在三个时期种子的大小不同，在 S1 时期就已经出现种子大小差异，在S2和S3阶段种子大小差异更显著。

2. 转录组测序分析发现，总共有 47848、47715、 42894、34579 转录本在 V1 品种的S1、 S2、S3-1、S3-2 中表达，在 V2 品种中的各个时期表达转录本数为 48218、 48109、41530、33446（FPKM＞0.5）。选取了 6 个基因进行qRT-PCR 验证，验证结果与转录组测序结果一致。

3. 差异基因筛选结果（筛选标准 FPKM >5，FDR<0.01，log 2 fold change >1 or <-1）：在 S1 时期， V1S1 与 V2S1相比，973 个基因的表达显著不同；V1 与 V2 相比，有 489 个基因显著上调，484个基因显著下调；在 S2 时期，485 和476 个基因显著上调和下调；在 S3 时期，310 和 222 个基因显著上调和下调。在 S3 子叶样本中, V1S3-2 与 V2S3-2 相比，241 个基因显著表达不同。

4. 过滤掉 FPKM < 0.05 基因，剩余 7359 个基因进行 WGCNA 分析。总共分为 12 个明显的模块（不同的颜色标记），其中 4 个共表达模块构成的基因在单一样本类型中都高度表达（红色下划线）。接下来，对 S1、S2、S3、V1 中特异的模块基因进行共表达和聚类分析寻找关键基因。S1 中关键基因包括：甘油-3-磷酸酰基转移酶、ATP 柠檬酸盐-裂解酶、β-葡糖苷酶、脱落酸 8'-羟化酶、β-胡萝卜素 15、15'-单加氧酶和长链酰基辅酶 A 合成酶。S2 中关键基因包括：细胞分裂素合成酶、过氧化物酶、细胞分裂素反式羟化酶、细胞色素 P450 家族、3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase 等。S3 中关键基。因为 BR 信号传导激酶。V1 中关键基因为 DNA 导向 RNA 聚合酶 II 亚型 RPB7。

5. 在 Williams 82 中，过表达细胞色素 P450 家族基因 GmCYP78A5 (Glyma.05G019200)，与野生型植株相比，转基因品系的种子的大小和重量显著增加。

参考文献

Du J, Wang S, He C, et al . Identification of regulatory networks and hub genes controlling soybean seedset and size using RNA sequencing analysis. J Exp Bot 2017; 68(8): 1955-1972. (IF: 5.667)

案例四：ROS 在柠条锦鸡儿种子萌发重建耐干旱调控机制种的作用（无参）

研究背景

在正常种子中，干燥耐受性（DT）是在发育过程中逐渐获得的，接近于储存组分积累的末期。但是 DT 并不是在所有物种中都表达，通常认为 DT 是由一个复杂的调控网络严格控制的。目前还是缺乏一个模型系统来研究 DT，在某种程度上，这对 DT 特性的理解造成了障碍。

研究内容

欧易生物携手北京林业大学，选择柠条锦鸡儿作为研究物种，重点研究活性氧 ROS 在重建 DT 中的潜在调节作用。

图-1 研究思路

图-2 柠条锦鸡儿中与 DT 重建相关的差异表达基因功能分类

研究结果

1. DT 与种子发芽进程呈现负相关。

2. PEG 孵育会诱导 DT 重建，但是 DT 重建也取决于种子萌发的阶段，且不同种子组织对干燥有不同的敏感性，其中发芽种子中胚根对干燥最敏感，其次是下胚轴和子叶。此外，PEG 浓度、温度、种子的原始含水量等也是 DT 重建的影响因素。

3. 为了研究在 PEG 诱导后 ROS 是否在重建 DT 中起作用，进一步用实验确定了 ROS 的含量和位置。NBT 染色结果显示主要在根尖处观察到 O₂-。根尖区域的 H2DCF-DA 染色结果表明，PEG（1、2 和 3 天）和 H₂O₂ 处理组相比对于对照组和抑制剂（NAC）处理组，ROS 积累更多，但是要少于 CuSO₄处理组。这些结果表明，PEG 胁迫诱导 ROS 增加。同时也表明 H₂O₂可以代替 PEG 作为 DT 重建的诱导物。

4. 分别将 NAC 和氟啶酮添加到 ABA 和 H₂O₂溶液中，再对种子进行孵育，结果发现前者孵育的所有胚根尖都不能生存下来；但是与 H₂O₂ 处理的种子相比，在 H₂O₂中加氟啶酮后 DT 没有显着变化。这些数据表明 H₂O₂通过 ABA 影响 DT 重建。

5. 对 untreated、PEG-treated 和 H₂O₂ -treated 样本进行转录组测序，分析表明 ROS 介导 DT 重建与参与苯丙烷类黄酮途径的关键基因上调有关，且在 ROS 处理后总黄酮含量和关键酶活性增加。

6. 功能试验：将 PAL（苯丙素-类黄酮途径中的第一种酶）抑制剂 AIP，加入到 H₂O₂溶液中，结果显示 AIP 会抑制 H₂O₂诱导 DT 重建。

7. ROS 通过调节胁迫相关基因和苯丙烷类黄酮途径在 DT 重建中发挥重要作用。

参考文献

Peng L, Lang S, Wang Y, et al. Modulating role of ROS in re-establishing desiccation tolerance in germinating seeds of Caragana korshinskii Kom. J Exp Bot 2017; 68(13): 3585-3601. (IF: 5.667)

常见问题

1. 转录组测序是否可以同时检测 mRNA、miRNA 及其他非编码 RNA？

理论上技术是可行的，但是通常会根据测序对象长度的不同，在测序建库的时候会选择不同的片段大小，测序读长也会有不同。一般来讲，如果要进行 small RNA 测序的话，通常将 microRNA 分离出来，单独进行测序。mRNA 测序，通常建库时选择 200-300 bp 大小片段，采用 125 PE/150 PE 测序。而长链非编码 RNA（lncRNA）存在正向转录和反向转录，所以常采用去除 rRNA 后进行链特异性建库测序原则。

2. 转录组测序需要多少测序量？

由于转录组测序需要进行表达量的分析，因此不推荐使用覆盖度，在确定测序量时，我们以产生的reads数作为依据。转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。