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空间转录组项目疑虑多?小欧为您来解惑~

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新年伊始,欧易生物空间转录组项目元气满满地开工啦~ ~ ~
 

自2020年正式开展空间转录组项目以来,欧易生物已经完成500+例样本正式建库,涉及到的实验物种(含植物样本)和样本类型超过50例,同时也收到广大老师们对实验室小伙伴优秀贴片技巧的认可。

随着我们项目经验的增多,小欧在这里整理出空间转录组实验中一些老师们较为关心的问题,帮助老师们更好地了解空间转录组。
 

各位老师们还记得空间转录组的实验流程四部曲嘛?来和小欧一起回顾一下吧!空间转录组实验四部曲分别是:样本准备,质检染色,透化优化,正式实验。怎么样~是不是特别简单好记呢?下面,小欧就按照这四部分的顺序,分别解答老师们关心的问题。

俗话说万事开头难,空间转录组项目的开始是样本的准备,那么我们在样本准备方面都遇到过什么样“难解”的问题呢?
 

问:组织采集后,血迹比较多,是不是应该在PBS或生理盐水里清洗一下?

答:不可以哦~液体容易渗入组织,在组织冰冻或包埋时会产生冰晶,影响切片质量。

问:先冰冻后包埋会不会影响实验结果?

答:不会影响实验结果,但如果组织没冰冻好,会产生冰晶损伤,还是建议各位老师取到组织后先包埋再冰冻。

问:1个模具里可以放多个组织吗?

答:不建议,最好将每个组织块单独包埋,防止多个组织在1个OCT包埋块中无法同时切到预期的目标区域。

问:为什么有些植物组织需要抽真空包埋?

答:部分植物组织因其自身原因(有种皮包被等情况)在包埋过程中无法完全被OCT包裹,导致切片时发生碎裂、堆叠,或者样本从OCT中脱落等现象,而抽真空可以帮助OCT更好地包埋植物组织,减少后期实验失败的风险。

当样本准备好,就可以送到欧易生物开始质检啦。实验的结果有时就像“六月天,孩儿面”,有顺利的晴天,也有不尽如人意的阴天,甚至糟糕的雷雨天。造成结果不理想的原因其实并不多,请听小欧为您一一解析:
 

问:同一样本为什么重复抽提结果不一致?

答:空间转录组项目仅收集组织样本的少量切片进行RNA抽提质检,并非整块组织的总RNA,不同切片位置对应的组织在RNA完整性上可能存在差异,尤其是切片的组织部位有坏死或大部分为结缔组织,可能会影响抽提结果。


问:如何判断切面已达到最大面?

答:被包埋冰冻后的样本是无法肉眼判断最大切面的,如果需要准确判断组织的最大切面,可以在包埋时(组织刚放入OCT中还未冰冻前)拍照并做好记录以供参考。


问:为什么冰冻切片染色很难达到常规石蜡切片的染色效果?

答:冰冻切片与石蜡切片的实验目的不同,使用的染色液和染色方法也不同,冰冻切片需要尽可能保证RNA的完整,所以在染色过程中不会使用分色液、二苯、乙醇等,而石蜡样本则无需考虑这一点。


问:空间转录组为什么不封片?

答:空间转录组项目后续的正式实验(反转录和cDNA合成)都需要在正式玻片上进行,封片后无法继续实验,为保持前期切片质检和正式实验相同的实验流程和条件,一般都不做封片处理。


问:如果老师需要其他染色结果,怎么办?

答:老师可以联系我们实验室小伙伴,我们可以将切好的白片提供给老师,以便进行其他方法的染色。


问:植物样本为什么存在脱片现象?

答:植物样本切片中含较多纤维或淀粉的部位黏着性较低,极易发生脱片,极少数的动物组织样本例如骨样本,钙质较高,也容易发生脱片。


问:切片脱片可以提前预警吗?

答:可以。当质检或透化过程中任一环节出现脱片现象时,即预示着正式实验过程中有极大可能出现脱片现象。

质检完成之后,距离正式实验只差1个透化优化预实验啦!预实验也是各位老师问的最多的实验环节,那么到底是哪些问题让各位老师产生了困惑呢?
 

问:为什么要做透化优化?

答:确认组织透化释放出RNA的最佳时间,便于正式实验透化时可直接选用最佳的透化时间。

问:4个样本都要做透化吗?

答:建议最好每个样本均进行透化,因为就算是组织类型完全相同的2个样本,也可能存在最佳透化条件不同的情况。

问:透化为什么要重新切片?

答:透化优化需要使用空转特定的TO芯片,因此,在完成质检后,需要老师选择好做透化实验的样本重新切片,然后才能在TO芯片上贴片进行透化预实验。

问:通透的时间梯度是多久呢?

答:3-30min,分为3min、6min、12min、18min、24min、30min共6个梯度,这个梯度一般情况下是固定的,特殊情况下,也可以根据实验经验进行微调。

 

问:透化优化选的切片位置必须是6.5mm*6.5mm的目标区域吗?

答:最好是目标区域或靠近目标区域,因为同一组织中若存在不同结构,透化时间也不相同,6.5mm*6.5mm区域大小是为了和后面正式实验的大小相匹配,避免重复修块对组织产生不利影响(用刀片重复修块,可能影响组织形态及RNA质量)。

问:为什么荧光图上有的组织部位荧光强,有的部位荧光弱?

答:荧光图需要结合HE染色结果来看,荧光强度受细胞核密集程度影响,细胞核越密集,通透释放出的RNA越多,荧光越强,反之,细胞核越少,通透释放出的RNA越少,荧光越弱。


问:透化结果是如何判定的?

答:根据阴性对照判断组织是否有自发荧光,根据阳性对照判断批次试剂的正常。而最佳透化时间,则根据荧光强度和组织整体荧光表现以及荧光是否存在模糊弥散来判定。

当透化优化预实验完成,距离终点就只差正式实验的一小步啦!胜利的曙光就在眼前,但这个时候也不能放松警惕,不少参与了正式实验的老师在实验过程中也会提出这些问题:
 

问:正式实验为什么还要重新切片?

答:正式实验需要使用10x Genomics的基因表达玻片,在选择好样本及6.5mm*6.5mm的目标区域之后,需要重新切片再贴片到正式玻片上开展后续实验。

问:组织切片的大小一定要控制在6.5mm*6.5mm吗?

答:空间转录组的基因表达玻片捕获区为6.5mm*6.5mm,超出大小的组织切片将不会被捕获到,捕获区边框不属于捕获区,需要保留3/4捕获区边框,用于后期数据分析确认图像方向。

问:贴到玻片上的样本可以取下重新贴吗?

答:不可以,样本切片靠雾化粘附到玻片上,无法完整取下切片,而且基因表达玻片上有引物,重新贴片一定会导致引物的脱落,影响实验结果。

问:正式实验的组织切片形状为什么和质检的切片不一样?

答:正式实验要重新贴片,中间会经历10张以内的修片,修片可能会使组织切面发生改变。

问:1个捕获区可以贴多个组织吗?

答:默认1个捕获区贴片1张,若组织切片较小,可以尝试在不重叠的情况下贴多张(一般不超过5张)到同一个捕获区域。

问:质检的时候没有冰晶,为什么正式实验的时候可能会有冰晶?

答:虽然样本质检的时候没有冰晶,但后期实验切片需从-80℃拿出至-20℃的切片机,会有反复冻融的情况存在,导致样本产生少量冰晶。当然,此情况较为少见,目前只在1类样本中发现冻融产生的冰晶。

问:4个样本的最佳透化时间不同,可以在一张芯片上实验吗?

答:可以,只要不是时间相差太久就没问题。
 

好啦,以上就是小欧的答疑啦,不知道有没有帮助到各位老师呢?如有没说清楚的地方,小欧期待各位老师的留言~ ~ ~
 

PS:比馒头还干的干货,各位确定不评论转发吗?(让我看看是谁在偷偷学习,准备内卷)

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End本文系欧易生物原创

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